Laser di Thulium ad onda continua per la cottura delle cellule coltivate per indagare gli effetti termici cellulari
Summary
Viene introdotto un setup sperimentale originale per le celle di riscaldamento in un piatto di coltura utilizzando radiazioni laser a onda continua da 1,94 μm. Utilizzando questo metodo, le risposte biologiche delle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) dopo diverse esposizioni termiche possono essere studiate.
Abstract
Viene introdotto un metodo originale per riscaldare le cellule coltivate usando un laser di thulium a onda continua da 1,94 μm per la valutazione biologica. La radiazione laser di tiulio è fortemente assorbita dall'acqua e le cellule nella parte inferiore del piatto di coltura vengono riscaldate attraverso la diffusione termica. Una fibra laser con un diametro di 365 μm è impostata circa 12 cm al di sopra del piatto di coltura, senza alcuna ottica, in modo tale che il diametro del fascio laser sia quasi equivalente al diametro interno del piatto di coltura (30 mm). Tenendo una quantità consistente di campioni di coltura in ogni esperimento, è possibile irradiare le cellule con un aumento di temperatura altamente riproducibile.
Per calibrare l'aumento della temperatura e la sua distribuzione in un piatto di coltura cellulare per ogni impostazione di potenza, la temperatura è stata misurata durante 10 s di irradiazione in posizioni diverse e a livello cellulare. La distribuzione della temperatura è stata rappresentata utilizzando un software grafico matematicoProgramma, e il suo modello attraverso il piatto della cultura era in forma gaussiana. Dopo l'irradiazione laser, potrebbero essere eseguiti diversi esperimenti biologici per valutare le risposte delle cellule dipendenti dalla temperatura. In questo manoscritto viene introdotta la colorazione della vitalità ( cioè distinguere le cellule vive, apoptotiche e morte) per aiutare a determinare le temperature di soglia per l'apoptosi cellulare e la morte dopo diversi punti nel tempo.
I vantaggi di questo metodo sono la precisione della temperatura e del tempo di riscaldamento, nonché la sua elevata efficienza nelle celle di riscaldamento in un intero impianto di coltura. Inoltre, consente di studiare con un'ampia varietà di temperature e durate, che possono essere ben controllate da un sistema operativo computerizzato.
Introduction
La comprensione delle risposte biologiche delle cellule dipendenti dalla temperatura è di grande importanza per i trattamenti di ipertermia con successo. La fotocoagulazione laser retinica con un laser termico, utilizzata in oftalmologia, è uno dei trattamenti laser più rinomati della medicina. La luce visibile, per lo più da lunghezze d'onda di verde a giallo, viene usata nel trattamento laser retinico. La luce è altamente assorbita dal melanina nelle cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE), che costituiscono il monostrato cellulare più esterno della retina. Interessanti interessi tra medici e ricercatori in irraggiamento termico molto lieve (fotocoagulazione sub-visibile) come nuova strategia terapeutica per diversi tipi di disturbi della retina 1 , 2 . A seguito di questa tendenza, il nostro interesse è quello di sottoporre letti a calore le cellule RPE sotto controllo preciso della temperatura, una tecnica chiamata terapia fototermica controllata dalla temperatura (TC-PTT).
Opto recenteLa tecnologia acustica del nostro istituto ha consentito di misurare in tempo reale gli aumenti di temperatura nei siti irradiati nella retina. Ciò consente di controllare l'aumento della temperatura durante l'irradiazione 3 . Tuttavia, poiché l'ipertermia sub-letale sulla retina, causata dalla riscaldamento delle cellule RPE sotto-letali, non è stata precedentemente considerata a causa dell'impossibilità di misurare e controllare la temperatura, le risposte delle cellule RPE dipendenti dalla temperatura dalle cellule RPE dopo l'irradiazione laser termico Sono stati studiati molto poco fino ad oggi. Inoltre, non solo la differenza di temperatura non è stata discussa in dettaglio, ma anche la differenza nel comportamento delle cellule delle cellule sopravvissute dopo irradiazione sub-letale e letale. Pertanto, per raccogliere prove scientifiche sui trattamenti basati su TC-PTT, ci proponiamo di chiarire le risposte biologiche delle cellule RPE dipendenti dalla temperatura e dai loro meccanismi utilizzando strutture sperimentali in vitro .
Per tIl suo scopo è stabilire un impianto di riscaldamento a cellule che soddisfi le seguenti condizioni: 1) possibilità di aumenti di temperatura veloci, 2) tempo e temperatura precisi e 3) un numero relativamente elevato di cellule esaminate per esperimenti biologici . Per quanto riguarda il metodo di riscaldamento, un laser clinico, come un laser Nd.YAG raddoppiato a frequenza (532 nm), è purtroppo inadatto per il riscaldamento della coltura cellulare. Questo è dovuto al numero fortemente ridotto di melanosomi nelle cellule RPE coltivate. L'assorbimento della luce laser potrebbe essere inomogeneo e l'aumento della temperatura a livello cellulare è variabile tra gli esperimenti, anche quando irradiato con la stessa potenza radiante. Numerosi studi precedenti hanno riportato l'uso di carta nera sotto il fondo del piatto durante l'irradiazione 4 o l'uso di melanosomi aggiuntivi che sono fagocitizzati dalle cellule di coltura prima degli esperimenti 5 , 6 . Molti diGli studi biologici in vitro per la valutazione delle reazioni cellulari indotte da ipertermia sono state eseguite usando una piastra calda, un bagno d'acqua o un incubatore di CO 2 con una regolazione della temperatura 7 . Questi metodi richiedono un lungo periodo di riscaldamento perché richiede un certo tempo ( cioè diversi minuti) per raggiungere la temperatura desiderata. Inoltre, utilizzando questi metodi, è difficile ottenere una storia termica dettagliata ( cioè la temperatura moltiplicata per il tempo) a livello cellulare. Inoltre, la temperatura tra le cellule in posizioni diverse in un piatto di coltura può variare a causa della diffusione a temperatura variabile. Nella maggior parte dei casi, queste informazioni di temperatura temporali e spaziali durante l'ipertermia non sono state prese in considerazione per le analisi biologiche, anche se la risposta biologica cellulare può essere criticamente influenzata dalla temperatura e dalla durata della temperatura aumentata.
Per superare questi problemi, un contaIl laser di thulium a nuous wave è stato usato qui per riscaldare le cellule. La radiazione laser di tiulio (λ = 1,94 μm) è fortemente assorbita dall'acqua 8 e le cellule al fondo del piatto di coltura sono stimolate termicamente solo attraverso la diffusione termica. La fibra laser con un diametro di 365 μm è fissata a circa 12 cm al di sopra del piatto di coltura, senza alcuna ottica fra. Il diametro del fascio laser diviene tale che è quasi equivalente al diametro interno del piatto di coltura (30 mm) alla superficie del mezzo di coltura. Con una quantità consistente di terreno di coltura è possibile irradiare le cellule con l'aumento della temperatura Di alta ripetibilità. Le impostazioni di potenza variabili consentono l'irraggiamento fino a 20 W e la temperatura media a livello cellulare può essere aumentata fino a ΔT ≈ 26 ° C per 10 s.
Modificando le condizioni di irraggiamento, è anche possibile modificare il profilo del fascio laser per variare la temperatura distribuitaIn un piatto di cultura. Ad esempio, è possibile indagare con una distribuzione di temperatura simile a Gaussian, come nell'attuale studio, o con una distribuzione omogenea della temperatura. Quest'ultimo può essere vantaggioso per indagare gli effetti delle risposte delle cellule dipendenti dalla temperatura più specificamente per gli aumenti di temperatura sub-letali, ma non per gli stress di morte cellulare o le reazioni di guarigione delle ferite.
Nel complesso, l'irradiazione laser del tiume può consentire l'individuazione di diversi fattori biologici, come l'espressione genico / proteica, la cinetica della morte cellulare, la proliferazione cellulare e lo sviluppo delle funzionalità delle cellule dopo diverse esposizioni termiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel discutere le risposte cellulari biologiche correlate alla temperatura, non è solo la temperatura, ma anche la durata di tempo della temperatura aumentata, poiché la maggior parte dei processi biochimici dipende dal tempo. Particolarmente nel campo della ipertermia indotta dal laser in oculistica, a causa del breve periodo di tempo – da millisecondi a secondi – è difficile studiare gli effetti termici cellulari con un preciso controllo della temperatura. Pertanto, è desiderabile un'impostazione di irradiazion…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca del Ministero Federale tedesco della Pubblica Istruzione e della Ricerca (BMBF) (sovvenzione # 13GW0043C) e di un ufficio europeo per la ricerca e lo sviluppo aerospaziale (EOARD, concedere il numero # FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
References
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
