Непрерывный волновой тулиевый лазер для нагревательных клеток, предназначенных для исследования клеточных тепловых эффектов
Summary
Здесь вводится оригинальная экспериментальная установка для нагрева клеток в культуральной чаше с использованием лазерного излучения непрерывной волны 1,94 мкм. Используя этот метод, можно исследовать биологические реакции эпителиальных клеток эпителия сетчатки (РПЭ) после различных термических воздействий.
Abstract
Здесь вводится оригинальный метод нагрева культивируемых клеток с использованием непрерывного волнового лазера с непрерывной волной 1,94 мкм для биологической оценки. Тулиевое лазерное излучение сильно поглощается водой, а клетки на дне культуральной чашки нагреваются посредством тепловой диффузии. Лазерное волокно диаметром 365 мкм устанавливается около 12 см над культуральной чашкой без какой-либо оптики, так что диаметр лазерного луча почти эквивалентен внутреннему диаметру культуральной тарелки (30 мм). Сохраняя постоянное количество культуральной среды в каждом эксперименте, можно облучать клетки с сильно воспроизводимым повышением температуры.
Для калибровки увеличения температуры и ее распределения в одной чашке для культивирования клеток для каждой установки мощности измеряли температуру в течение 10 с облучения в разных положениях и на клеточном уровне. Распределение температуры было представлено с использованием программного обеспечения для математической графикиПрограмма, и ее образец в блюде культуры был в гауссовой форме. После лазерного облучения можно было провести различные биологические эксперименты для оценки зависимых от температуры реакций клеток. В этой рукописи вводится окраска жизнеспособности ( т. Е. Различение живых, апоптотических и мертвых клеток), чтобы помочь определить пороговые температуры для апоптоза клеток и смерти после разных точек времени.
Достоинствами этого метода являются точность температуры и времени нагрева, а также ее высокая эффективность в нагревании ячеек в блюде культуры целых клеток. Кроме того, он позволяет проводить исследования с широким диапазоном температур и продолжительности времени, которые могут быть хорошо контролируемыми компьютеризированной операционной системой.
Introduction
Понимание зависимых от температуры клеточных биологических реакций имеет большое значение для успешного лечения гипертермии. Лазерная фотокоагуляция сетчатки с термическим лазером, используемая в офтальмологии, является одним из наиболее известных методов лечения лазеров в медицине. Видимый свет, в основном от зеленой до желтой длины волны, используется при лазерной обработке сетчатки. Свет сильно поглощается меланином в эпителиальных клетках сетчатки сетчатки (РПЭ), которые образуют внешний клеточный монослой сетчатки. Недавно среди врачей и исследователей был интерес к очень мягкому термическому облучению (субвидимая фотокоагуляция) в качестве новой терапевтической стратегии для различных видов нарушений сетчатки 1 , 2 . Следуя этой тенденции, наш интерес заключается в подсолевом нагревании клеток RPE при точном контроле температуры, методе терморегулируемой фототермической терапии (TC-PTT).
Недавний оптАкустическая технология нашего института позволила измерять повышение температуры в реальном времени на облученных участках сетчатки. Это позволяет контролировать увеличение температуры при облучении 3 . Однако, поскольку сублетальная гипертермия на сетчатке, вызванная нагреванием клеток РПЭ подлето, ранее не рассматривалась из-за невозможности измерения и контроля температуры, зависящие от температуры реакции клеток клеток РПЭ после термического лазерного облучения Были очень мало изучены до настоящего времени. Кроме того, не только различие температур не обсуждалось подробно, но также и разница в поведении клеток выживших клеток после сублетального и летального облучения. Поэтому, чтобы собрать научные данные о методах, основанных на ТС-РТТ, мы стремимся выяснить связанные с температурой биологические реакции клеток РПЭ и их механизмы, используя экспериментальные установки in vitro .
Для tЕго цель, необходимо установить установку нагрева ячейки, которая удовлетворяет следующим условиям: 1) возможность быстрого повышения температуры, 2) точно контролируемое время и температура и 3) относительно большое количество исследованных клеток для биологических экспериментов , Что касается метода нагрева, то, к сожалению, для нагрева клеточной культуры клейкий лазер, такой как лазер Nd.YAG с частотным удлинением (532 нм), не подходит. Это связано с сильно уменьшенным числом меланосом в культивируемых клетках RPE. Поглощение лазерного света может быть неоднородным, и повышение температуры на клеточном уровне является переменным между экспериментами, даже при облучении той же мощностью излучения. В нескольких предыдущих исследованиях сообщалось об использовании черной бумаги под днищем тарелки во время облучения 4 или использовании дополнительных меланосом, фагоцитированных клетками культуры до экспериментов 5 , 6 . Многие изБиологические исследования in vitro для оценки гипертермических реакций клеток проводились с использованием горячей плиты, водяной бани или инкубатора CO 2 с установлением температуры 7 . Эти методы требуют длительного периода нагрева, так как для достижения желаемой температуры требуется некоторое время ( т. Е. Несколько минут). Кроме того, используя эти методы, трудно получить подробную температурную историю ( т. Е. Температуру, умноженную на время) на клеточном уровне. Более того, температура между клетками в разных положениях в одной блюде культуры может отличаться из-за переменной температурной диффузии. В большинстве случаев эта временная и пространственная информация о температуре во время гипертермии не была принята во внимание для биологических анализов, даже если реакция биологических клеток может быть критически затронута температурой и продолжительностью времени повышенной температуры.
Чтобы преодолеть эти проблемы,Для нагрева ячеек использовался тюль-лазер с непрерывной волной. Тулиевое лазерное излучение (λ = 1,94 мкм) сильно поглощается водой 8 , а клетки на дне культуральной чашки термически стимулируются исключительно за счет тепловой диффузии. Лазерное волокно диаметром 365 мкм установлено примерно на 12 см выше чашки для культивирования, без какой-либо оптики между ними. Диаметр лазерного луча расходится так, что он почти эквивалентен внутреннему диаметру культуральной чашки (30 мм) на поверхности культуральной среды. При постоянном количестве культуральной среды можно облучать клетки с повышением температуры Высокой повторяемости. Переменные параметры мощности позволяют облучать до 20 Вт, а температура среды на клеточном уровне может быть увеличена до ΔT ≈ 26 ° C за 10 секунд.
Модифицируя условия облучения, можно также изменить профиль лазерного луча, чтобы изменить распределение температурыНа блюде культуры. Например, можно исследовать гауссовское распределение температуры, как в текущем исследовании, или с однородным распределением температуры. Последнее может быть выгодным для исследования эффектов зависимых от температуры реакций на клетки более конкретно для повышения уровня смертности, а не для стресса со смертельным исходом или реакции заживления ран.
В целом облучение тулиевым лазером может позволить исследовать различные виды биологических факторов, таких как экспрессия гена / белка, кинетика смерти клеток, клеточная пролиферация и развитие функциональных свойств клеток после различных термических воздействий.
Protocol
Representative Results
Discussion
При обсуждении связанных с температурой биологических клеточных реакций важна не только температура, но также и продолжительность времени повышенной температуры, поскольку большинство биохимических процессов зависят от времени. В частности, в области лазерной гипертермии в офтальм…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом исследования Федерального министерства образования и исследований Германии (BMBF) (грант № 13GW0043C) и Европейского бюро аэрокосмических исследований и разработок (EOARD, грант # FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
References
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
