Laser de Thulium de onda contínua para aquecimento de células cultivadas para investigar efeitos térmicos celulares
Summary
Uma configuração experimental original para células de aquecimento em um prato de cultura usando radiação laser de onda contínua de 1,94 μm é introduzida aqui. Utilizando este método, as respostas biológicas das células epiteliais do pigmento da retina (RPE) após diferentes exposições térmicas podem ser investigadas.
Abstract
Um método original para o aquecimento de células cultivadas usando um laser de túlio de onda contínua de 1,94 μm para avaliação biológica é introduzido aqui. A radiação do laser de Thulium é fortemente absorvida pela água, e as células no fundo do prato de cultura são aquecidas através da difusão térmica. Uma fibra a laser com um diâmetro de 365 μm é ajustada a cerca de 12 cm acima da placa de cultura, sem qualquer óptica, de modo que o diâmetro do feixe laser seja quase equivalente ao diâmetro interno da placa de cultura (30 mm). Ao manter uma quantidade consistente de meio de cultura em cada experiência, é possível irradiar as células com um aumento de temperatura altamente reprodutível.
Para calibrar o aumento de temperatura e sua distribuição em um prato de cultura de células para cada ajuste de potência, a temperatura foi medida durante 10 s de irradiação em diferentes posições e no nível celular. A distribuição de temperatura foi representada usando um software de gráficos matemáticosPrograma, e seu padrão no prato de cultura estava em forma Gaussiana. Após irradiação a laser, diferentes experiências biológicas podem ser realizadas para avaliar as respostas celulares dependentes da temperatura. Neste manuscrito, é introduzida a coloração da viabilidade ( isto é, distinguindo células vivas, apoptóticas e mortas) para ajudar a determinar as temperaturas limiares para apoptose celular e morte após diferentes pontos no tempo.
As vantagens deste método são a precisão da temperatura e do tempo de aquecimento, bem como a sua alta eficiência no aquecimento de células em um conjunto de cultura de células inteiras. Além disso, permite estudar com uma grande variedade de temperaturas e durações do tempo, que podem ser bem controladas por um sistema operacional computadorizado.
Introduction
Compreender respostas biológicas de células dependentes da temperatura é de grande importância para tratamentos de hipertermia com sucesso. A fotocoagulação a laser retinal com um laser térmico, usado em oftalmologia, é um dos tratamentos a laser mais estabelecidos em medicina. A luz visível, principalmente de comprimentos de onda verde para amarelo, é utilizada no tratamento com laser retiniano. A luz é altamente absorvida pela melanina nas células epiteliais do pigmento da retina (RPE), que formam a monocamada celular mais externa da retina. Houve um interesse recente entre médicos e pesquisadores em irradiação térmica muito leve (fotocoagulação sub-visível) como uma nova estratégia terapêutica para diferentes tipos de distúrbios retinianos 1 , 2 . Seguindo essa tendência, nosso interesse é subalternamente aquecer células RPE sob controle preciso de temperatura, uma técnica chamada terapia fototérmica controlada por temperatura (TC-PTT).
Opção recenteA tecnologia acústica do nosso instituto permitiu a medição em tempo real dos aumentos de temperatura em locais irradiados na retina. Isso permite o controle sobre o aumento da temperatura durante a irradiação 3 . No entanto, uma vez que a hipertermia sub-letal na retina, causada pelo aquecimento de células RPE sub-letal, não foi previamente considerada devido à impossibilidade de medir e controlar a temperatura, as respostas celulares dependentes da temperatura de células RPE após irradiação laser térmica Foi estudado muito pouco até à data. Além disso, não só a diferença de temperatura não foi discutida em detalhes, mas também a diferença no comportamento celular das células sobreviventes após irradiação sub-letal e letal. Portanto, para reunir evidências científicas sobre tratamentos baseados em TC-PTT, buscamos elucidar as respostas biológicas das células RPE dependentes da temperatura e seus mecanismos usando configurações experimentais in vitro .
Para tSeu propósito, é necessário estabelecer uma instalação de aquecimento celular que atenda às seguintes condições: 1) uma possibilidade de aumento rápido da temperatura, 2) um tempo e temperatura precisamente controlados, e 3) um número relativamente alto de células examinadas para experiências biológicas . Quanto ao método de aquecimento, um laser clínico, como um laser Nd.YAG com freqüência de dupla (532 nm), infelizmente não é adequado para o aquecimento da cultura celular. Isto é devido ao número fortemente reduzido de melanosomas em células RPE cultivadas. A absorção da luz laser pode ser não homogênea, e o aumento da temperatura no nível celular é variável entre experiências, mesmo quando irradiado com a mesma potência de radiação. Vários estudos anteriores relataram o uso de papel preto abaixo do fundo do prato durante a irradiação 4 ou o uso de melanosomas adicionais que são fagocitadas pelas células da cultura antes das experiências 5 , 6 . MuitosOs estudos biológicos in vitro para avaliar as respostas celulares induzidas pela hipertermia foram realizados usando uma placa quente, um banho de água ou uma incubadora de CO 2 com um ajuste de temperatura 7 . Estes métodos requerem um longo período de aquecimento porque leva algum tempo ( ou seja, vários minutos) para atingir a temperatura desejada. Além disso, usando esses métodos, é difícil obter um histórico térmico detalhado ( isto é, temperatura multiplicada pelo tempo) no nível celular. Além disso, a temperatura entre as células em diferentes posições em um prato de cultura pode diferir devido à difusão de temperatura variável. Na maioria dos casos, esta informação de temperatura temporal e espacial durante a hipertermia não foi levada em consideração para análises biológicas, mesmo que a resposta das células biológicas possa ser afetada criticamente pela temperatura e pela duração do tempo de aumento da temperatura.
Para superar esses problemas, um contiO laser de thulium de onda nu foi usado aqui para aquecer as células. A radiação do laser de túlio (λ = 1,94 μm) é fortemente absorvida pela água 8 e as células no fundo do prato de cultura são estimuladas termicamente apenas através da difusão térmica. A fibra laser com um diâmetro de 365 um é ajustada a cerca de 12 cm acima da placa de cultura, sem qualquer óptica no meio. O diâmetro do feixe laser diverge de modo que é quase equivalente ao diâmetro interno do prato de cultura (30 mm) na superfície do meio de cultura. Com uma quantidade consistente de meio de cultura, é possível irradiar as células com o aumento de temperatura De alta repetibilidade. As configurações de potência variável permitem a irradiação com até 20 W e a temperatura média no nível celular pode ser aumentada até ΔT ≈ 26 ° C em 10 s.
Ao modificar as condições de irradiação, também é possível alterar o perfil do raio laser para variar a distribuição de temperaturaEm um prato de cultura. Por exemplo, é possível investigar com uma distribuição de temperatura Gaussiana, como no estudo atual, ou com uma distribuição de temperatura homogênea. Este último pode ser vantajoso para investigar os efeitos das respostas celulares dependentes da temperatura mais especificamente para aumentos de temperatura sub-letais, mas não para estresse da morte celular ou para respostas de cicatrização de feridas.
No total, a irradiação com laser de thulium pode permitir a investigação de diferentes tipos de fatores biológicos, como a expressão de genes / proteínas, cinética de morte celular, proliferação celular e desenvolvimento de funcionalidade celular, após diferentes exposições térmicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao discutir as respostas celulares biológicas relacionadas à temperatura, não só a temperatura, mas também a duração do tempo do aumento da temperatura, é importante, uma vez que a maioria dos processos bioquímicos dependem do tempo. Particularmente no campo da hipertermia induzida por laser em oftalmologia, devido ao curto intervalo de tempo, de milissegundos a segundos, é difícil investigar os efeitos térmicos celulares com um controle preciso da temperatura. Portanto, é desejável uma instalação de irr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF) (concessão nº 13GW0043C) e de um Escritório Europeu de Pesquisa e Desenvolvimento Aeroespacial (EOARD, concessão nº FA9550-15-1-0443)
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | Add (2)-(4) before use. Warm in 37°C water bath before use. |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use. |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM) |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%) |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R&D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Thulium laser | Starmedtec GmbH | Prototype | 0-20 W |
| 365 mm core diameter fiber | LASER COMPONENTS Germany | CF01493-52 | |
| Thermocouple | Omega Engineering Inc | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| Heating plate | MEDAX | ||
| Microplate reader (spectrofluorometer) | Molecular Device | Spectramax M4 | |
| cell homogenizer | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| Fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| mathematical software program | The Mathworks. Inc | MATLAB Release 2015b | |
| system-design platform | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
References
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