Efficiënte Sporulatie van<em> Saccharomyces cerevisiae</em> In een 96 Multiwell Format

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

Sporulatie in de gist is bestudeerd om inzicht in vele aspecten van de biologie, met inbegrip van de controle van chromosoomsegregatie bieden tijdens meiose ^1, mechanismen voor genetische recombinatie ^2, de controle van de ontwikkeling van cell signaling ^3, nutritionele regeling van ontwikkeling ^4, de transcriptionele regulering van de ontwikkeling ^5, en het onderzoek van de spore vorming ^6. Spoorvorming omvat een nieuwe celdeling gebeurtenis waarbij de vorming van nieuwe membraancompartimenten binnen de moedercel gevolgd door het afzetten van een beschermende spore wand ^6. Deze studies die sporenvormende cellen onderzocht vaak gebruik maken van het snel sporulerende giststam SK1, die het proces van sporulatie in ongeveer 24 uur op een relatief efficiënte wijze ^7,8 kan ondergaan. Hoewel optimalisering van sporulatie voorwaarden voor gist zijn beschreven ^9-13, die experiments onderzocht sporulatie op vaste media of in grotere schaal vloeibare culturen waar sporulatie met behulp van cultuur buisjes of flesjes wordt uitgevoerd.

Hier beschrijven we een werkwijze voor sporenvormende gist in een 96 multi-putjesplaat formaat. We zien dat deze werkwijze beluchting is kritisch voor synchrone en efficiënt sporulatie en hebben technieken ontwikkeld om voldoende sporulatie garanderen een klein volume multiwell format. Sporenvormende in een 96 multi-putjesplaat formaat maakt cellen worden gescreend met behulp van high-throughput technieken en reagentia geoptimaliseerd voor een multiwell plaat formaat, zoals screening voor hoog kopie onderdrukkers met een betegelde library ^14-16.

Protocol

1. Voorbereidingen voor Sporulatie Let op:. De in dit protocol beschreven media worden gemaakt met behulp van standaard recepten en methodes 13,17 Tabel 1 geeft de formulering voor 1 liter van de verschillende media gebruikt in dit protocol. <td style=…

Representative Results

Dit protocol te evalueren werden sporulatie rendementen verkregen van sporenvormende cellen in platen met meerdere putjes (zoals hierboven beschreven) vergeleken met cellen gesporuleerde gebruik van grotere volumes in flessen (tabel 2). Het gebruik van multi-putjesplaten heeft de hoge efficiëntie gezien wanneer sporulerend in flessen, waarbij ~ 80% rendement routinematig blijkt niet bereiken. Sporenvormende in multiwell platen met goede beluchting (door glasparels…

Discussion

Hier presenteren we een protocol voor sporulerend SK1 gist in een 96 multiwell format. Beluchting is belangrijk voor een efficiënte sporulatie, waarbij het gebruik van hetzij een roerstaaf of een glasparel in elk putje vereist. Wanneer cellen worden gesporuleerde in een 96 multiwell plaat in een incubator schudden zonder begeleiding van een kraal of een roerstaafje, hoeft cellen niet efficiënt sporuleren. Slechts een kleine toename van sporulatie efficiëntie wordt waargenomen wanneer de cellen gesporuleerde zonder da…

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4