Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
Esporulação na levedura de brotamento foi estudado para fornecer insights sobre muitos aspectos da biologia, incluindo o controle da segregação cromossômica durante a meiose 1, os mecanismos de recombinação genética 2, o controle do desenvolvimento de sinalização celular 3, controle nutricional do desenvolvimento 4, a transcrição regulação do desenvolvimento 5, eo exame de formação de esporos 6. A formação de esporos inclui um evento de divisão celular romance que envolve a formação de novos compartimentos membranares dentro da célula mãe, seguido pela deposição de uma parede de esporos 6 protectora. Estes estudos que examinam as células esporuladas muitas vezes tirar proveito da estirpe de levedura rapidamente esporulantes SK1, que pode sofrer o processo de esporulação em cerca de 24 horas de um modo relativamente eficiente 7,8. Embora a optimização das condições de esporulação de brotamento de levedura foram descritas 9-13, estes experimentos examinados esporulação em meios sólidos ou em culturas líquidas de maior escala, onde a esporulação é efectuada utilizando tubos de cultura ou frascos.
Descrevemos aqui um método para a esporulação de levedura num formato de placa de poços múltiplos 96. Nós achamos que para este método, aeração é crítica para a esporulação síncrona e eficiente, e desenvolveram técnicas para garantir a esporulação suficiente um formato com vários poços de pequeno volume. Esporulantes num formato de 96 placa de poços múltiplos permite a células a ser rastreada utilizando técnicas de alto rendimento e reagentes optimizados para um formato de placa de poços múltiplos, tais rastreio de supressores elevado de cópias usando uma biblioteca de azulejos 14-16.
Aqui apresentamos um protocolo para esporulação levedura SK1 em um formato com vários poços 96. O arejamento é a chave para a esporulação eficiente, que requer a utilização de qualquer uma barra de agitação ou um cordão de vidro em cada poço. Quando as células são esporulados em uma placa com múltiplas cavidades 96 numa incubadora com agitação sem qualquer uma pérola ou uma vareta de agitação, as células não esporular eficientemente. Apenas um pequeno aumento na eficiência de esporulação é vis…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Joseph P. Healey, da Universidade de Massachusetts Boston (LSH) e R15 GM86805 do NIH (LSH). SMP é suportado em parte por uma Sanofi-Genzyme Fellowship da Universidade de Massachusetts Boston.
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |