נביגה יעילה של<em> שמר האפייה</em> בתוך פורמט 96 multiwell
Summary
Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
Abstract
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
Introduction
נביגה ב השמרים ניצני נחקרה לספק תובנות היבטים רבים של הביולוגיה, כולל שליטה על הפרדה כרומוזום במהלך המיוזה 1, מנגנוני שחלוף 2, שליטה של פיתוח על ידי התא איתות 3, שליטה התזונתי של פיתוח 4, תעתיק הסדרת פיתוח 5, ובחינת יצירת הנבגים 6. יצירת נבגים כוללת אירוע חלוקת תא רומן מעורב ההיווצרות של תאי קרום חדשים בתוך תא אמא ואחריו בתצהיר של קיר נבג מגן 6. מחקרים אלה הבוחנים תאים sporulating מנצלים לעתים קרובות זן שמרים sporulating במהירות sK1, אשר יכול לעבור תהליך של נביגה בערך 24 שעות בצורה יעילה יחסית 7,8. למרות אופטימיזציה של תנאי נביגה בשביל נבגי שמרים תוארו 9-13, אלה לביצוע הניסויs בחן נביגה על התקשורת מוצק או נוזלי בתרבויות בקנה מידה גדול יותר שבו נביגה מתבצעת באמצעות צינורות תרבות או צלוחיות.
כאן אנו מתארים שיטה sporulating שמרים במתכונת צלחת multiwell 96. אנו מוצאים כי בשיטה זו, אוורור הוא קריטי עבור נביגה סינכרוני ויעיל, פיתחו טכניקות כדי להבטיח נביגה מספיק בפורמט multiwell קטן-נפח. Sporulating במתכונת צלחת multiwell 96 מאפשר לתאים להיות מוקרנים באמצעות טכניקות תפוקה גבוהה ריאגנטים מותאם במיוחד בפורמט צלחת multiwell, הקרנה כזה מדכאי גבוהה עותק באמצעות ספריית רעפים 14-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול sporulating שמרים sK1 במתכונת multiwell 96. אוורור הוא מפתח עבור נביגה יעילה, אשר מחייבת שימוש או בר ומערבב או חרוז זכוכית בכל טוב. כאשר תאים התנבג בצלחת multiwell 96 בתוך חממה רועדת בלי שאחד חרוז או ומערבבים ברים, תאים אינם sporulate ביעילות. רק עלייה קטנה יעילות נבי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ג'וזף פ הילי מאוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון (LSH) ו R15 GM86805 מ- NIH (LSH). SMP הוא נתמך בחלקו על ידי עמיתי Sanofi-ג'נזיים באוניברסיטת מסצ'וסטס בבוסטון.
Materials
| Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
| Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
| 3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
| 5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
| 96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
| library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
| rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
| Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
| Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
| Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
| Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
| Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |
References
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Génétique. 196 (1), 31-63 (2014).
- Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
- Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
- Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Génétique. 192 (1), 73-105 (2012).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 189 (3), 737-765 (2011).
- Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
- Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
- McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
- Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker’s yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
- Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
- Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
- Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836 (2011).
- Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. , (2016).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , (2005).
- Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
- Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
- Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).
