Effektiv sporulation av<em> Saccharomyces cerevisiae</em> I en 96 multibrønn Format

Summary

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Abstract

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Introduction

Sporulering i det spirende gjær har blitt studert for å gi innsikt i mange aspekter av biologi, herunder kontroll av kromosom segregering under meiose ^1, mekanismer for rekombinasjon ^2, kontroll av utviklingen av cellesignalisering ^3, ernæringsmessige kontroll av utviklingen ^4, den transkripsjonelle regulering av utvikling ^5, og undersøkelse av sporedannelse ^6. Sporedannelse omfatter en ny celledeling hendelse som medfører dannelse av nye membran oppbevaringsrom innenfor modercellen, fulgt av avsetning av et beskyttende sporevegg ^6. Disse studiene som undersøker sporedannende celler ofte dra nytte av den raskt sporedannende gjærstamme SK1, som kan gjennomgå prosessen med sporulation i ca 24 timer på en relativt effektiv måte ^7,8. Selv om optimalisering av sporulation vilkår for spirende gjær har blitt beskrevet ^9-13, disse eksperiments kontrollert sporedannelsen på fast medium eller i større skala flytende kulturer der sporedannelsen utføres ved anvendelse av kultur rør eller kolber.

Her beskriver vi en fremgangsmåte for sporedannende gjær i en 96 flerbrønn plateformat. Vi finner at for denne metoden, er kritisk for synkron og effektiv sporulering lufting, og har utviklet teknikker for å sikre tilstrekkelig sporulering et lite volum for flere brønner format. Sporedannende i en 96 multiwell plate format gjør det mulig for cellene å bli vist ved hjelp av high-throughput teknikker og reagenser som er optimalisert for en multiwell plate format, slik screening for høye kopidempere ved hjelp av en flislagt bibliotek ^14-16.

Protocol

1. Forberedelse til sporulation Merk:. Mediene er beskrevet i denne protokollen er laget ved hjelp av standard oppskrifter og metoder 13,17 Tabell 1 viser formuleringen for en L av de ulike mediene som brukes i denne protokollen. <td style="width: 55px…

Representative Results

For å vurdere denne protokollen, ble sporulering effektivitet oppnådd fra sporedannende celler i multibrønnplater (som beskrevet ovenfor) sammenlignet med celler sporulerte ved hjelp av større volumer i kolber (tabell 2). Bruk av multibrønnplater oppnådde ikke den høye effektiviteten sett når sporedannende i kolber, hvor ~ 80% virkningsgrad kan rutinemessig sett. Sporedannende i multibrønnplater med passende lufting (levert av glassperler eller rør bar) k…

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for sporedannende SK1 gjær i en 96 multiwell format. Lufting er viktig for effektiv sporulation, som krever bruk av enten en rørepinne eller et glass perle i hver brønn. Når cellene er sporulerte i en 96 flerbrønn plate i en risteinkubator uten enten en vulst eller en rørestav, gjør cellene ikke sporulere effektivt. Bare en liten økning i sporulering effektivitet blir sett når cellene sporulerte uten enten en vulst eller en rørestav i en risteinkubator, forhold til å være ved …

Materials

Nunc 1.3 ml DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	Used for sporulation
Nunc 2.0 ml DeepWell plates	ThermoScientific	278743	Used for presporulation growth, step 1.2.3
3 mm glass bead	Fisher	11-312A	Used for sporulation
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12	Fisher	14-511-82	Used for sporulation
96 well frogger	V&P Scientific	VP407	needed for step 1.2
library copier	V&P Scientific	VP381	needed for step 1.2; to be used with the frogger
rectangular petri dish	ThermoScientific	264728	needed for step 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	needed for media
Yeast Extract	BD	212750	needed for media
Bacto Agar	BD	212750	needed for media
Dextrose	Fisher	D16-3	needed for media
Potassium Acetate	Fisher	P171-500	needed for media
Glycerol	Fisher	G33-500	needed for media
Black 96 well glass bottom plate	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	needed for step 2.4