Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Optogenetische gereedschappen zijn steeds populairder, mede omdat ze kunnen worden gebruikt om de bedrading van signaalwegen 1-4 ontcijferen. Zij zijn gebaseerd op het vermogen van activeerbare eiwitten om hun conformatie en bindingsaffiniteit veranderen wanneer verlicht met licht. Fuseren van deze eiwitten aan signalering elementen zorgt voor de specifieke regeling van een enkele speler binnen complexe intracellulaire signaalroutes 5-12. Bijgevolg kan een signaleringsroute worden bestudeerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
De meeste cellen gebaseerde studies optogenetic gebruik microscopie gebaseerde methoden gecombineerd met kweken in de aanwezigheid van licht, gevolgd door biochemische analyse 11,12. Daarentegen een flowcytometer singularitseert cellen langs een capillaire en meet celgrootte en granulariteit fluorescentie-intensiteiten. Deze werkwijze heeft grote voordelen ten opzichte van microscopische of biochemische werkwijzen, waaronder de mogelijkheid duizend g analyserends van levende cellen bij eencellige resolutie in een zeer korte tijd. Daarom is het wenselijk om optogenetics combineren met flowcytometrie.
Voor zover wij weten, is er geen vastgesteld protocol voor optogenetic flowcytometrie. Een algemeen aanvaarde procedure handmatig cellen verlichten van buiten de reactiebuis met flitslicht apparaten. Echter, handmatige belichting in de stroom vereist cytometer het licht door de reactie buis te passeren en, voor live-cell imaging, een cilindrische, verwarmd waterreservoir. Dit veroorzaakt aanzienlijke lichtverstrooiing en lichtverlies. Bovendien, de lichtintensiteit door handmatige belichting niet reproduceerbaar tussen experimenten (hoek, afstand, etc.) en er een praktische grens aan het aantal golflengten in één experiment.
Door het construeren van de LED Thermo stromingsinrichting, waren we in staat om deze beperkingen te overwinnen. Met deze inrichting kunnen cellen worden verlicht met specifieke golflengten in een temp-Erature gecontroleerde wijze tijdens flowcytometrische metingen. Dit zorgt voor nauwkeurige en reproduceerbare hoeveelheden licht binnen en tussen experimenten.
Om het nut van onze inrichting in vivo te demonstreren, namen we het fluorescentiesignaal van Dronpa in Ramos B-cellen tijdens photoswitching. Ramos B-cellen zijn afgeleid van een menselijk Burkitt-lymfoom. Dronpa een fluorescent eiwit dat bestaat als een monomeer, dimeer of tetrameer. In zijn monomere vorm, niet-fluorescerend. Belichting met 400 nm licht induceert dimerisatie en tetramerisatie en maakt de Dronpa eiwit fluorescent. Dit proces kan door belichting met 500 nm licht. De Dronpa proteïne is gebruikt om de functie en locatie van signaaleiwitten 4,13 beheersen.
Hier, uitgedrukt we een Dronpa-Linker-Dronpa eiwit in Ramos B-cellen photoswitching van Dronpa bestuderen in een flowcytometer. Met behulp van onze apparaat, waren we in staat om efficiënt enreproduceerbaar PHOTOSWITCH Dronpa tijdens het opnemen van de fluorescentie-intensiteit in real time. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de huidige verlichting protocollen met handmatige belichting en aanzienlijk verbreedt de experimentele repertoire voor optogenetic gereedschappen en kooi verbindingen. Met behulp van onze apparaat zal aanzienlijk vereenvoudigen en versnellen van de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe optogenetische gereedschappen.
De LED Thermo Flow is een innovatief apparaat om optogenetic gereedschappen studeren in een flowcytometer.
Tot nu toe hebben optogenetic monsters werden alleen verlicht met microscopie lasers of zaklamp apparaten 11,12. Afhankelijk van de hoek en de afstand van de zaklamp om het monster wordt aanzienlijke verschillen in de hoeveelheid belichting verwacht tussen experimenten. Verder is er een limiet aan het aantal zaklampen een persoon kan werken in een experiment. Dit beperkt de e…
The authors have nothing to disclose.
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |