LED الحرارية تدفق - الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
تم أدوات علم البصريات الوراثي تكتسب شعبية، في جزء منه لأنها يمكن أن تستخدم لفك الأسلاك من مسارات الإشارات 1-4. وهي تستند إلى قدرة بروتينات photoactivatable تغيير على التشكل وملزمة تقارب عندما مضيئة مع الضوء. دمج هذه البروتينات لعناصر إشارات تسمح لتنظيم محدد من لاعب واحد داخل معقدة مسارات الإشارات بين الخلايا 5-12. وبالتالي، فإن مسار الإشارات يمكن دراستها مع القرار الزماني والمكاني عالية.
معظم الدراسات علم البصريات الوراثي القائم على خلية تستخدم أساليب تعتمد على المجهر جنبا إلى جنب مع زراعة في وجود الضوء، تليها تحليل الكيمياء الحيوية 11،12. في المقابل، تدفق singularizes الكريات الخلايا على طول شعري ويقيس حجم الخلية، تحبب وكثافة مضان. هذا الأسلوب له مزايا كبيرة خلال الفحص المجهري أو البيوكيميائية الطرق، بما في ذلك القدرة على تحليل thousanس من الخلايا في قرار وحيدة الخلية تعيش في وقت قصير جدا. وبالتالي، فمن المستحسن أن الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي.
على حد علمنا، ليس هناك بروتوكول تأسيس لالتدفق الخلوي علم البصريات الوراثي. إجراء مقبولة على نطاق واسع هو إلقاء الضوء خلايا يدويا من خارج أنبوب تفاعل مع الأجهزة مصباح يدوي. ومع ذلك، والإضاءة اليدوية في تدفق يتطلب الكريات ضوء أن يمر من خلال أنبوب رد فعل، ولتصوير الخلايا الحية، أسطواني، وغرفة للمياه ساخنة. هذا يسبب تشتت الضوء كبير وفقدان للضوء. وعلاوة على ذلك، فإن شدة الضوء التي تقدمها إضاءة يدوية ليست استنساخه بين التجارب (زاوية، والمسافة، الخ) وليس هناك حد عملي لعدد من موجات في تجربة واحدة.
عن طريق بناء جهاز LED الحرارية التدفق، كنا قادرين على التغلب على هذه القيود. مع هذا الجهاز، وخلايا يمكن أن تكون مضيئة مع موجات محددة في درجة الحرارةالطريقة أثناء قياس تدفق cytometric التي تسيطر عليها erature. وهذا يسمح لكميات محددة وقابلة للتكرار للضوء داخل وبين التجارب.
للتدليل على فائدة الجهاز لدينا في الجسم الحي، سجلنا إشارة مضان من Dronpa في الخلايا راموس B خلال photoswitching. وتستمد الخلايا راموس B من سرطان الغدد الليمفاوية بوركيت البشري. Dronpa هو ببروتين موجود كما مونومر، ديمر أو tetramer. في شكله أحادى، فمن غير الفلورسنت. الإضاءة مع 400 نانومتر الخفيفة الحث dimerization وtetramerization ويجعل البروتين الفلوري Dronpa. هذه العملية يمكن عكسها من خلال الإضاءة مع 500 نانومتر الخفيفة. وقد استخدم البروتين Dronpa للسيطرة على وظيفة، والمكان من الإشارات البروتينات 4،13.
هنا، أعربنا عن بروتين Dronpa-رابط-Dronpa في الخلايا راموس B لدراسة photoswitching من Dronpa في قياس التدفق الخلوي. استخدام الجهاز لدينا، كنا قادرين على كفاءة وبتكاثر photoswitch Dronpa أثناء تسجيل كثافة مضان في الوقت الحقيقي. وهذه الطريقة توفر مزايا كبيرة عبر بروتوكولات الإضاءة الحالية مع إضاءة يدوية ويوسع بشكل كبير من ذخيرة تجريبي للأدوات علم البصريات الوراثي والمركبات القفص. استخدام الجهاز لدينا سيسهل بشكل كبير والإسراع في اكتشاف وتطوير أدوات علم البصريات الوراثي جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
والحرارية تدفق الصمام هو أداة مبتكرة لدراسة أدوات علم البصريات الوراثي في عداد الكريات التدفق.
حتى الآن، تم مضيئة عينات علم البصريات الوراثي فقط مع الليزر المجهر أو الأجهزة مصباح يدوي 11،12. اعتمادا على زاوية ومسافة المص?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
