LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
그들은 1-4 경로 신호의 배선를 해독하는데 사용할 수 있기 때문에 Optogenetic 도구 부분에서 인기를 얻어왔다. 이들은 광이 조명 될 때 그 형태 및 결합 친화도를 변경하는 광활성 단백질의 능력에 기초한다. 신호 요소에이 단백질을 융합하는 복잡한 세포 내 신호 전달 경로 5-12 내에서 단일 플레이어의 특정 규제 수 있습니다. 결과적으로, 신호 전달은 높은 공간적 해상도를 연구 할 수있다.
대부분의 셀 기반 optogenetic 연구 생화학 분석 11,12 뒤에 빛의 존재하에 배양 결합 현미경 기반 방법을 사용한다. 대조적으로, 플로우 사이토 모세관 따라 세포 단수형 셀 크기, 입도 및 형광 강도를 측정한다. 이 방법은 thousan 분석 할 수있는 기능을 포함하여 현미경 또는 생화학 적 방법에 비해 큰 장점을 가지고 있습니다매우 짧은 시간에 단일 셀 해상도에서 살아있는 세포의 DS. 그러므로, 유동 세포 계측법에 optogenetics을 결합하는 것이 바람직하다.
우리의 지식에, optogenetic 유동 세포 계측법에 대한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 광범위하게 허용 절차는 수동 플래쉬 장치 반응 관 외부로부터 셀을 조명하기위한 것이다. 그러나, 유동의 수동 조명 사이토 생균 촬상 원통형 가열 수조를 들어, 반응 관을 통과하는 광을 필요로한다. 이것은 상당한 광 산란 빛의 손실이 발생합니다. 또한, 수동에 의해 제공된 조명의 광 강도 (등 각도 간격) 실험 간 재현성이없는 한 실험에서 파장의 수에는 실제적인 한계가있다.
LED가 열 유량 장치를 구성함으로써, 이러한 한계를 극복 할 수 있었다. 이 장치로, 세포는 임시의 특정 파장으로 조명 될 수있다erature 제어 유세포 측정 중에 방식. 이것은 내 실험 사이의 빛의 정확하고 재현성있는 양의 수 있습니다.
생체 내에서 우리의 장치의 유틸리티를 설명하기 위해, 우리는 photoswitching 동안 라모스 B 세포에서 Dronpa의 형광 신호를 기록했다. 라모스 B 세포는 인간 버킷 림프종으로부터 유도된다. Dronpa는 단량체, 이량 체 또는 사량 체로서 존재 형광 단백질이다. 그 단량체 형태에서, 비 형광이다. 400 nm의 빛 조명은 이량 및 테트라을 유도하고 Dronpa 단백질의 형광을 렌더링합니다. 이 프로세스는 500 nm의 광을 조사하여 반전 될 수있다. Dronpa 단백질은 단백질 4,13 시그널링의 기능과 위치를 제어하는 데 사용되어왔다.
여기, 우리는 사이토의 흐름에 Dronpa의 photoswitching을 연구하는 라모스의 B 세포에서 Dronpa-링커 Dronpa 단백질을 표현했다. 우리의 장치를 사용하여, 우리가 할 수 있었다 효율적이고실시간으로 그 형광 강도를 기록하는 동안 재현 Dronpa을 포토 스위치. 이 방법은 수동 조명 현재 조명 프로토콜을 통해 상당한 이점을 제공하고 크게 optogenetic 도구와 케이지 화합물에 대한 실험적인 레퍼토리를 넓혀. 크게 간소화 및 신규 optogenetic 도구의 발견과 개발을 촉진 할 우리의 장치를 사용.
Protocol
Representative Results
Discussion
LED가 열 흐름은 흐름 세포 계수기에 optogenetic 도구를 연구하는 혁신적인 장치입니다.
지금까지 optogenetic 샘플은 현미경 레이저 또는 플래시 장치 (11, 12)으로 조사되었다. 샘플을 플래쉬의 각 거리에 따라 조도의 양의 상당한 변화는 실험간에 예상된다. 또한, 한 사람이 실험에서 동작 할 수 손전등의 개수에는 제한이있다. 이 실험 레퍼토리와 재현성을 제한합니다. 이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
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