LED Thermo Flow - שילוב Optogenetics עם cytometry זרימה
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
כלים optogenetic כבר צובר פופולריות, בין השאר משום שהם יכולים לשמש כדי לפענח את החיווט של מסלולי איתות 1-4. הם מבוססים על היכולת של חלבונים photoactivatable לשנות זיקה קונפורמציה ומחייבת שלהם, כאשר מואר באור. פיוזינג חלבונים אלה לאלמנטי איתות מאפשר להסדרה הספציפית של שחקן יחיד בתוך מסלולי איתות תאיים מורכבים 5-12. כתוצאה מכך, מסלול איתות ניתן ללמוד עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה.
רוב המחקרים optogenetic מבוססי תאים לנצל שיטות מיקרוסקופיה מבוססת בשילוב עם culturing בנוכחות אור, ואחריו ניתוח ביוכימיים 11,12. לעומת זאת, cytometer זרימת singularizes תאים לאורך נימים ומודד גודל תא, גרעיניות ו עוצמות קרינה. לשיטה זו יתרונות גדולים על פני שיטות מיקרוסקופיה או ביוכימיות, כולל היכולת לנתח thousands של תאים חיים ברזולוצית תא בודד בתוך זמן קצר מאוד. לפיכך, רצוי לשלב optogenetics עם cytometry הזרימה.
למיטב ידיעתנו, אין פרוטוקול הוקם עבור cytometry זרימת optogenetic. הליך מקובל רחב הוא להאיר תאים ידניים מחוץ צינור התגובה עם התקני פנס. עם זאת, תאורה ידנית את זרימת cytometer מחייבת לאור לעבור דרך צינור התגובה, הדמית תא חייה, גלילית, תא מים מחומם. זה גורם פיזור אור משמעותי ואובדן האור. יתר על כן, את עוצמת האור שמספקת תאורת מדריך אינה לשחזור בין ניסויים (זווית, מרחק וכו ') ויש מגבלה מעשית על מספר אורכי גל בניסוי אחד.
על ידי בניית מכשיר זרימת LED Thermo, הצלחנו להתגבר על המגבלות האלה. בעזרת התקן זה, אפשר להאיר תאים עם אורכי גל ספציפיים עובד זמניerature שבשליטת בצורה במהלך המדידות תזרים cytometric. זה מאפשר כמויות מדויקות לשחזור של אור בתוך ובין ניסויים.
כדי להדגים את התועלת של המכשיר שלנו in vivo, הקלטנו את אותות הקרינה של Dronpa בתאים ראמוס B במהלך photoswitching. תאי ראמוס B נגזרים לימפומה אדם Burkitt. Dronpa הוא חלבון פלואורסצנטי שקיים בתור מונומר, דימר או tetramer. בצורתו monomeric שלה, היא פלורסנט שאינן. תאורה עם 400 ננומטר אור גורם dimerization ו tetramerization והופך את חלבון פלואורסצנטי Dronpa. תהליך זה יכול להיות הפוך על ידי תאורה עם 500 ננומטר אור. חלבון Dronpa נעשה שימוש כדי לשלוט בפונקציית ומיקום של איתות חלבונים 4,13.
כאן, הביע לנו חלבון Dronpa-לינקר-Dronpa בתאי B ראמוס ללמוד photoswitching של Dronpa ב cytometer זרימה. השימוש במכשיר שלנו, הצלחנו ביעילותreproducibly photoswitch Dronpa בעת ההקלטה עוצמת הקרינה שלה בזמן אמת. שיטה זו מספקת יתרונות משמעותיים על פני פרוטוקולי תאורה נוכחיים עם תאורה ידנית באופן משמעותי מרחיבה את רפרטואר ניסיוני כלי optogenetic ותרכובות כלוב. השימוש במכשיר שלנו תפשט בצורה משמעותית להאיץ גילוי ופיתוח של כלים optogenetic הרומן.
Protocol
Representative Results
Discussion
The Flow LED Thermo הוא מכשיר חדשני ללמוד כלי optogenetic בתוך cytometer זרימה.
עד כה, דגימות optogenetic כבר מואר רק עם לייזרים מיקרוסקופיה או מכשירים פנס 11,12. בהתאם לזווית והמרחק של הפנס המדגם, לשונות נכרתו את כמות התאורה צפויה בין ניסויים. יתר על ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
