एलईडी थर्मो फ्लो - optogenetics से फ्लो के साथ मेल
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Optogenetic उपकरण हिस्से में लोकप्रिय हो रहा है, क्योंकि वे रास्ते 1-4 संकेत के तारों समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वे photoactivatable प्रोटीन की क्षमता है जब प्रकाश के साथ प्रकाशित उनकी रचना और बंधन आत्मीयता बदलने के लिए पर आधारित हैं। संकेत तत्वों को इन प्रोटीनों Fusing जटिल intracellular संकेत दे रास्ते 5-12 के भीतर एक एकल खिलाड़ी के विशिष्ट नियमन के लिए अनुमति देता है। नतीजतन, एक संकेतन मार्ग उच्च अस्थायी और स्थानिक संकल्प के साथ अध्ययन किया जा सकता है।
अधिकांश सेल आधारित optogenetic पढ़ाई के प्रकाश की उपस्थिति में संवर्धन के साथ संयुक्त माइक्रोस्कोपी आधारित विधियों, जैव रासायनिक विश्लेषण 11,12 के द्वारा पीछा उपयोग। इसके विपरीत, एक प्रवाह कोशिकामापी एक केशिका साथ कोशिकाओं singularizes और सेल आकार, विघटन और प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापता है। इस विधि माइक्रोस्कोपी या जैव रासायनिक तरीकों पर प्रमुख लाभ, हजार विश्लेषण करने की क्षमता भी शामिल हैबहुत ही कम समय में एकल कोशिका संकल्प पर जीवित कोशिकाओं के डी एस। इसलिए, यह प्रवाह cytometry के साथ optogenetics गठबंधन करने के लिए वांछनीय है।
हमारे ज्ञान करने के लिए, वहाँ optogenetic से फ्लो के लिए कोई स्थापित प्रोटोकॉल है। एक मोटे तौर पर स्वीकार कर लिया प्रक्रिया मैन्युअल टॉर्च उपकरणों के साथ प्रतिक्रिया ट्यूब के बाहर से कोशिकाओं को रोशन करने के लिए है। हालांकि, प्रवाह में मैनुअल रोशनी कोशिकामापी लाइव सेल इमेजिंग, एक बेलनाकार, गरम पानी कक्ष के लिए प्रतिक्रिया ट्यूब के माध्यम से पारित करने के लिए और प्रकाश की आवश्यकता है। यह पर्याप्त रोशनी बिखरने और प्रकाश की हानि का कारण बनता है। इसके अलावा, प्रकाश की तीव्रता का मार्गदर्शन रोशनी द्वारा प्रदान प्रयोगों (कोण, दूरी, आदि) के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं है और एक प्रयोग में तरंग दैर्ध्य की संख्या के लिए एक व्यावहारिक सीमा नहीं है।
एलईडी थर्मो प्रवाह डिवाइस का निर्माण करके, हम इन सीमाओं को पार करने में सक्षम थे। इस उपकरण के साथ, कोशिकाओं को एक अस्थायी में विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के साथ प्रकाशित किया जा सकता हैerature नियंत्रित प्रवाह cytometric माप के दौरान तरीके से। इस के भीतर और प्रयोगों के बीच प्रकाश की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा के लिए अनुमति देता है।
विवो में हमारे डिवाइस की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, हम photoswitching दौरान रामोस बी कोशिकाओं में Dronpa के प्रतिदीप्ति संकेत दर्ज की गई। रामोस बी कोशिकाओं एक मानव बुर्कीट लिंफोमा से निकाली गई है। Dronpa एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि एक मोनोमर, डिमर या टेट्रामर के रूप में मौजूद है। इसकी monomeric रूप में, यह गैर फ्लोरोसेंट है। 400 एनएम प्रकाश के साथ रोशनी dimerization और tetramerization लाती है और Dronpa प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रदान करता है। इस प्रक्रिया में 500 एनएम प्रकाश के साथ रोशनी से उलट हो सकता है। Dronpa प्रोटीन समारोह और प्रोटीन 4,13 संकेत के स्थान को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
यहाँ, हम रामोस बी कोशिकाओं में एक Dronpa-लिंकर-Dronpa प्रोटीन कोशिकामापी एक प्रवाह में Dronpa की photoswitching अध्ययन करने के लिए व्यक्त की है। हमारे डिवाइस का उपयोग करना, हम करने में सक्षम थे और कुशलताreproducibly Dronpa photoswitch वास्तविक समय में अपने प्रतिदीप्ति तीव्रता जबकि रिकॉर्डिंग। इस विधि का मार्गदर्शन रोशनी के साथ वर्तमान रोशनी प्रोटोकॉल पर पर्याप्त लाभ प्रदान करता है और काफी optogenetic उपकरण और पिंजरे यौगिकों के लिए प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची broadens। हमारे डिवाइस का उपयोग काफी सरल और डिस्कवरी और उपन्यास optogenetic उपकरणों के विकास को गति देगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
एलईडी थर्मो प्रवाह एक प्रवाह कोशिकामापी में optogenetic उपकरणों का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव उपकरण है।
अब तक, optogenetic नमूने केवल माइक्रोस्कोपी लेज़रों या टॉर्च उपकरणों 11,12 के साथ प्रकाशित किया ग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
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