LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
それらは経路1-4シグナルの配線を解読するために使用することができるので、光遺伝学ツールは、部分的に、人気を集めています。これらは、光を照射されたとき、それらの立体配座および結合親和性を変更するための光活性化タンパク質の能力に基づいています。シグナリング要素にこれらのタンパク質を融合して、複雑な細胞内シグナル伝達経路5-12内のシングルプレイヤーの特定の調節を可能にします。従って、シグナル伝達経路は、高い時間および空間分解能を用いて研究することができます。
ほとんどの細胞ベースの光遺伝学の研究では、生化学分析11,12に続く光の存在下での培養と組み合わせた顕微鏡ベースの方法を利用します。対照的に、フローサイトメーター、キャピラリーに沿って細胞をsingularizesセルサイズ、粒度と蛍光強度を測定します。この方法は、thousan分析する能力を含む、顕微鏡または生化学的方法を超える大きな利点を有しており、非常に短い時間で単細胞解像度で生細胞のDS。したがって、フローサイトメトリーを用いて光遺伝学を組み合わせることが望ましいです。
我々の知る限りでは、光遺伝学、フローサイトメトリーのための確立されたプロトコルはありません。広く受け入れられた手順は、手動で懐中電灯のデバイスとの反応管の外側から細胞を照射することです。しかし、フローのマニュアル照明は、サイトメーターの反応管を通過する光を必要とし、生細胞イメージング、円筒形、加熱された水室のため。これは、実質的な光散乱および光の損失を引き起こします。また、手動の照明によって提供される光強度は（ 等角度、距離、）実験間の再現性がないと一つの実験の波長の数には限界があります。
LEDサーモフロー装置を構築することによって、我々は、これらの制限を克服することができました。このデバイスでは、細胞は一時中で特定の波長で照射することができますフローサイトメトリー測定中erature制御方法。これは、実験内との間の光の正確で再現性の量を可能にします。
インビボでの我々の装置の有用性を実証するために、我々はphotoswitching中ラモスB細胞におけるドロンパの蛍光シグナルを記録しました。ラモスB細胞は、ヒトバーキットリンパ腫に由来します。ドロンパは、モノマー、ダイマーまたは四量体として存在する蛍光タンパク質です。そのモノマー形態では、非蛍光性です。 400 nmの光で照明は二量体化および四を誘導し、ドロンパタンパク質の蛍光をレンダリングします。このプロセスは、500 nmの光を照射することによって逆転させることができます。ドロンパタンパク質は、タンパク質4,13のシグナリング機能および位置を制御するために使用されています。
ここでは、フローサイトメーターでドロンパのphotoswitchingを研究するためにラモスB細胞にドロンパ – リンカー – ドロンパのタンパク質を発現しました。私たちのデバイスを使用して、我々は効率的にすることができたとリアルタイムでの蛍光強度を記録しながら再現性ドロンパをフォトスイッチ。この方法は、マニュアル照明で現在の照明プロトコルを介して実質的な利点を提供し、大幅に光遺伝学ツールとケージ化合物のための実験的なレパートリーを広げます。大幅に簡素化し、新たな光遺伝学ツールの発見と開発を加速する私たちのデバイスを使用しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
LEDサーモフローは、フローサイトメーターで光遺伝学ツールを研究するための革新的なデバイスです。
これまでのところ、光遺伝学のサンプルを顕微鏡レーザーや懐中電灯のデバイス11,12のみで照らされてきました。試料に懐中電灯の角度と距離に応じて、照明の量の大幅な変動が実験間で期待されています。また、1人での実験で動作することができる懐中電?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
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