LED Thermo Flow - Kombinere Optogenetics med flowcytometrisystemer
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Optogenetic verktøy har blitt stadig mer populært, delvis fordi de kan brukes til å dechiffrere kabling av signalveier 1-4. De er basert på evnen til photoactivatable proteiner til å endre sin konformasjon og bindingsaffinitet når belyst med lys. Fusing disse proteinene å signalelementer gjør det mulig for den konkrete reguleringen av en enkelt aktør innen komplekse intracellulære signalveier 5-12. Følgelig kan en signalveien bli studert med høy tidsmessig og romlig oppløsning.
De fleste cellebaserte undersøkelser optogenetic utnytte mikroskopi-baserte metoder kombinert med dyrking i nærvær av lys, etterfulgt av biokjemisk analyse 11,12. I motsetning til dette, et flowcytometer singularizes celler langs en kapillær og måler cellestørrelse, granularitet og fluorescensintensiteter. Denne metoden har store fordeler i forhold til mikroskopi eller biokjemiske metoder, inkludert muligheten til å analysere thousands av levende celler ved enkelt-celle-oppløsning i en meget kort tid. Derfor er det ønskelig å kombinere optogenetics med flowcytometri.
Så vidt vi vet, er det ingen etablert protokoll for optogenetic flowcytometri. En bredt akseptert prosedyre er å belyse celler manuelt fra utsiden reaksjonsrøret med lommelykt enheter. Imidlertid manuell belysning i flowcytometer krever at lyset passerer gjennom reaksjonsrøret, og for levende celle avbildning, en sylindrisk, oppvarmet vannkammer. Dette fører til betydelig lysspredning og tap av lys. Videre er lysintensiteten gitt ved manuell belysning ikke reproduserbare mellom eksperimenter (vinkel, avstand, etc.), og det er en praktisk grense for hvor mange bølgelengder i ett eksperiment.
Ved å konstruere LED Thermo Flow enhet, var vi i stand til å overvinne disse begrensningene. Med denne enheten, kan cellene bli belyst med bestemte bølgelengder i en temperature-kontrollert måte under strømningscytometriske målinger. Dette gjør det mulig for nøyaktige og reproduserbare mengder lys i og mellom eksperimenter.
For å demonstrere nytten av vår enhet in vivo, har vi registrert fluorescenssignalet av Dronpa på Ramos B-celler i løpet av photoswitching. Ramos B-celler er avledet fra et human Burkitt lymfom. Dronpa er et fluorescerende protein som eksisterer som en monomer, dimer eller tetramer. I sin monomere form, er det ikke-fluorescerende. Belysning med 400 nm lys induserer dimerization og tetramerization og gjengir Dronpa protein fluorescerende. Denne prosessen kan bli reversert ved belysning med 500 nm lys. Den Dronpa proteinet har blitt brukt til å styre funksjon og plassering av signaleringsproteiner 4,13.
Her uttrykte vi en Dronpa-linker-Dronpa protein i Ramos B-celler til å studere photoswitching av Dronpa i et strømningscytometer. Ved hjelp av vår enhet, var vi i stand til å effektivt ogreproduserbart photoswitch Dronpa under innspilling sin fluorescens intensitet i sanntid. Denne metoden gir betydelige fordeler i forhold til dagens belysning protokoller med manuell belysning og betydelig utvider eksperimentelle repertoar for optogenetic verktøy og bur forbindelser. Ved hjelp av vår enhet vil vesentlig forenkle og akselerere oppdagelsen og utviklingen av nye optogenetic verktøy.
Protocol
Representative Results
Discussion
LED Thermo Flow er en innovativ enhet for å studere optogenetic verktøy i et flowcytometer.
Så langt har optogenetic prøvene blitt opplyst bare med mikros laser eller lommelykt enheter 11,12. Avhengig av vinkelen og avstanden til lommelykten til prøven, er betydelig variasjon i mengden av lys forventes mellom eksperimenter. Videre er det en grense for hvor mange lommelykter en enkelt person kan operere i et eksperiment. Dette begrenser den eksperimentelle repertoaret og repro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
