LED Thermo Flow - Сочетание оптогенетика с проточной цитометрии
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Оптогенетика инструменты набирает популярность, отчасти потому , что они могут быть использованы , чтобы расшифровать проводку сигнальных путей 1-4. Они основаны на способности белков фотоактивируемых изменять свою конформацию и аффинностью связывания при освещении светом. Соединяя эти белки сигнальных элементов позволяет для конкретного регулирования одного игрока в сложных внутриклеточных сигнальных путей 5-12. Следовательно, путь передачи сигналов может быть исследована с высоким временным и пространственным разрешением.
Большинство сотовых на основе оптогенетика исследования используют методы микроскопии на основе в сочетании с культивированием в присутствии света с последующим биохимического анализа 11,12. В противоположность этому, проточный цитометр singularizes клеток вдоль капилляра и измеряет размер клеток, зернистость и интенсивности флуоресценции. Этот метод имеет значительные преимущества по сравнению с микроскопии или биохимических методов, в том числе способность анализировать thousanDS живых клеток при разрешении одноклеточного в очень короткое время. Следовательно, желательно, чтобы совместить оптогенетика с проточной цитометрии.
Насколько нам известно, не существует никакого установленного протокола для оптогенетика цитометрии. Широко принято процедура вручную освещать клетки снаружи реакционной трубки с фонариком устройствами. Тем не менее, ручное освещение в проточном цитометре требует свет, чтобы пройти через реакционную трубу и, для клеток живого изображения, цилиндрический, нагретой камере воды. Это приводит к тому существенное рассеивание света и потери света. Кроме того, интенсивность света, заданные вручную освещения не является воспроизводимой между экспериментами (угол, расстояние и т.д.) и существует практический предел числу длин волн в одном эксперименте.
Построив устройство LED Thermo Flow, мы смогли преодолеть эти ограничения. С помощью этого устройства, клетки могут быть освещен с определенными длинами волн в ТЕмпратуре-контролируемым образом в процессе измерений цитометрическими потока. Это позволяет точные и воспроизводимые количества света внутри и между экспериментами.
Чтобы продемонстрировать полезность нашего устройства в естественных условиях, мы записали флуоресценции сигнал Dronpa в клетках Ramos B во photoswitching. Ramos B клетки получают из человеческой лимфомы Беркитта. Dronpa представляет собой флуоресцентный белок, который существует в виде мономера, димера или тетрамера. В своей мономерной форме, она нефлуоресцирующего. Освещение с 400 нм светом вызывает димеризацию и тетрамеризации и делает белок флуоресцентной Dronpa. Этот процесс может быть отменено при освещении 500 нм светом. Белок Dronpa был использован для управления функцией и расположение сигнальных белков 4,13.
Здесь мы выразили белок Dronpa-линкер-Dronpa в В-клетках Ramos для изучения photoswitching из Dronpa в проточном цитометре. С помощью нашего прибора, мы смогли эффективно ивоспроизводимо photoswitch Dronpa во время записи его интенсивность флуоресценции в реальном времени. Этот метод обеспечивает существенные преимущества по сравнению с современными протоколами освещения с ручным освещения и значительно расширяет экспериментальный репертуар оптогенетика инструментов и каркасных соединений. С помощью нашего прибора позволит значительно упростить и ускорить открытие и разработку новых инструментов оптогенетика.
Protocol
Representative Results
Discussion
Thermo Flow LED представляет собой инновационное устройство для изучения оптогенетика инструментов в цитометр потока.
До сих пор оптогенетика образцы были освещены только с микроскопией лазерами или фонарика устройств 11,12. В зависимости от угла и расстояния фонаря к об…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
