LED Thermo Flow - Kombinera optogenetik med flödescytometri
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Optogenetic verktyg har allt populärare, delvis på grund av att de kan användas för att dechiffrera ledningsdragningen för signalvägar 1-4. De är baserade på förmågan hos fotoaktiverbara proteiner för att förändra sin konformation och bindningsaffiniteten när belyses med ljus. Fusing dessa proteiner till signaleringselement medger specifika regleringen av en enda aktör inom komplexa intracellulära signalvägar 5-12. Följaktligen kan en signalväg studeras med hög temporal och spatial upplösning.
De flesta cellbaserade optogenetic studier utnyttjar mikroskopi baserade metoder i kombination med odling i närvaro av ljus, följt av biokemisk analys 11,12. I motsats, ett flöde singularizes cytometer celler längs en kapillär och mäter cellstorlek, granularitet och fluorescensintensiteter. Denna metod har stora fördelar jämfört med mikroskopi eller biokemiska metoder, inklusive möjligheten att analysera tusen guldds av levande celler vid encelliga upplösning på mycket kort tid. Följaktligen är det önskvärt att kombinera optogenetik med flödescytometri.
Så vitt vi vet finns det ingen etablerad protokoll för optogenetic flödescytometri. En allmänt accepterade förfarandet är att manuellt belysa celler utanför reaktionsröret med ficklampa enheter. Men manuell belysning i flödet kräver cytometern ljuset att passera genom reaktionsröret och för levande cell imaging, ett cylindriskt, uppvärmt vatten kammaren. Detta orsakar betydande ljusspridning och förlust av ljus. Dessutom är inte reproducerbar mellan experiment (vinkel, avstånd, etc.) ljusstyrkan från manuell belysning och det finns en praktisk gräns för antalet våglängder i ett experiment.
Genom att konstruera LED Thermo Flow-enhet, kunde vi övervinna dessa begränsningar. Med den här enheten, kan celler belysas med specifika våglängder i en tempratur-kontrollerat sätt under flödescytometriska mätningar. Detta möjliggör exakta och reproducerbara mängder av ljus inom och mellan experiment.
För att demonstrera användbarheten av vår enhet in vivo, inspelad vi fluorescenssignalen av Dronpa i Ramos B-celler under photoswitching. Ramos B-celler är härledda från ett humant Burkitts lymfom. Dronpa är ett fluorescerande protein som existerar som en monomer, dimer eller tetramer. I dess monomera form, är det icke-fluorescerande. Belysning med 400 nm ljus inducerar dimerisering och tetramerisation och gör Dronpa protein fluorescerande. Denna process kan vändas genom belysning med 500 nm ljus. Den Dronpa protein har använts för att styra funktion och placering av signalproteiner 4,13.
Här, uttryckte vi en Dronpa-Linker-Dronpa protein i Ramos B-celler för att studera photoswitching av Dronpa i en flödescytometer. Med hjälp av vår enhet, kunde vi effektivt ochreproducerbart photoswitch Dronpa under inspelning dess fluorescensintensitet i realtid. Denna metod ger väsentliga fördelar jämfört med nuvarande belysningsprotokoll med manuell belysning och avsevärt breddar den experimentella repertoaren för optogenetic verktyg och bur föreningar. Med vår enhet kommer att avsevärt förenkla och påskynda upptäckt och utveckling av nya optogenetic verktyg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lysdioden Thermo Flow är en innovativ anordning för att studera optogenetic verktyg i en flödescytometer.
Hittills har optogenetic prover belysts endast med mikroskopi laser eller ficklampa anordningar 11,12. Beroende på vinkeln och avståndet av ficklampan till provet, är avsevärd variation i mängden belysning förväntas mellan experiment. Dessutom finns det en gräns för hur många ficklampor en enda person kan fungera i ett experiment. Detta begränsar den experimentel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
