LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren
Summary
Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.
Abstract
Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.
Introduction
Onlar yolları 1-4 sinyal kablolarını deşifre etmek için kullanılabilir, çünkü optogenetic araçlar kısmen, popülerlik kazanmaktadır. Işıkla aydınlatıldığında, kendi yapısını ve bağlanma afinitesini değiştirme fotoaktıfleştırılebılır proteinlerin yeteneğine dayanmaktadır. Sinyalizasyon elemanları bu proteinlerin kaynaştırarak karmaşık hücre içi sinyal yollarının 5-12 içinde tek bir oyuncunun belirli düzenlenmesi için izin verir. Sonuç olarak, bir sinyal yolu yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile ele alınabilir.
Çoğu hücre bazlı Optogenetic çalışmalarda biyokimyasal analiz 11,12 ardından ışık varlığında kültürlenmesi ile birlikte mikroskopi dayalı yöntemler kullanmaktadır. Bunun aksine, akış sitometresi kılcal boyunca hücrelerin singularizes ve hücre boyutu, boyutu ve floresan yoğunlukları ölçülür. Bu yöntem thousan analiz yeteneği dahil olmak üzere mikroskopi veya biyokimyasal yöntemlerle üzerinde önemli avantajlara sahiptirÇok kısa bir süre içinde tek hücreli çözünürlükte yaşayan hücrelerin DS. Bu nedenle, akış sitometrisi ile optogenetics birleştirilmesi arzu edilir.
Bildiğimiz kadarıyla, optogenetic flow sitometri için kurulan protokol yoktur. Bir yaygın olarak kabul prosedür el feneri cihazları ile reaksiyon tüpü dışından hücreleri aydınlatmaktır. Bununla birlikte, akış kılavuzu aydınlatma sitometresi canlı hücre görüntüleme, bir silindirik, ısıtılmış su odası, reaksiyon borusu içinden geçen ve ışık gerektirir. Bu önemli bir ışık saçılması ve ışık kaybına neden olur. Ayrıca, manuel aydınlatma tarafından sağlanan ışık yoğunluğu (vb açı, mesafe,) deneyler arasında tekrarlanabilir değildir ve bir deneyde dalga boylarının sayısı için pratik bir sınır yoktur.
LED Thermo Akış cihazı inşa ederek, bu sınırlamaları aşmak için başardık. Bu cihaz sayesinde, hücreler, bir sıcaklığı belirli dalga boyları ile aydınlatılabilirkısa süreli olarak kontrol edilen akış sitometrik ölçümleri sırasında bir şekilde. Bu mesafede olan ve deneyler arasında ışık hassas ve tekrarlanabilir miktarda sağlar.
In vivo olarak, bizim cihazın kullanılmasını göstermek için, photoswitching sırasında Ramos B hücrelerinde Dronpa floresan sinyali kaydedilmiştir. Ramos B hücreleri, bir insan Burkitt lenfoma türetilir. Dronpa bir monomer, dimer ya da tetramer olarak var olan bir fluoresan proteindir. monomerik formda, bu ışıltısızdır. 400 nm ışık ile aydınlatma dimerizasyonu ve tetramerizasyonu uyarır ve Dronpa protein floresan vermektedir. Bu süreç, 500 nm ışık ile aydınlatma ile ters olabilir. Dronpa protein proteinler 4,13 sinyal fonksiyonu ve yerini kontrol etmek için kullanılmaktadır.
Burada, bir akış sitometresinde Dronpa arasında photoswitching çalışma Ramos B hücrelerinde Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa proteini ifade etmiştir. Bizim cihaz kullanarak, başardık verimli vegerçek zamanlı olarak floresan yoğunluğu kayıt sırasında tekrarlanabilir Dronpa photoswitch. Bu yöntem, manuel aydınlatma ile mevcut aydınlatma protokolleri üzerinden önemli avantajlar sağlamaktadır ve önemli ölçüde optogenetic araçları ve kafes bileşikleri için deneysel repertuarı genişletir. önemli ölçüde basitleştirmek ve yeni Optogenetic araçlarının keşif ve gelişimini hızlandıracak bizim aygıtının kullanılması.
Protocol
Representative Results
Discussion
LED Thermo Akış bir akış sitometresinin içinde optogenetic araçları incelemek için yenilikçi bir cihazdır.
Şimdiye kadar, optogenetic numuneler sadece mikroskopi lazerler veya el feneri cihazlarla 11,12 ile aydınlatılan edilmiştir. örnek el feneri açısı ve mesafeye bağlı olarak, aydınlatma miktarında önemli değişkenlik deneyler arasında bekleniyor. Ayrıca, tek bir kişi bir deney çalışabilir fenerleri sayısında bir sınır yoktur. Bu deneysel repert…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank J. Schmidt from the University of Freiburg for constructing the device. We thank P. Nielsen and D. Medgyesi for their support and critical reading of this manuscript. This study was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft through SFB746 and by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
Materials
| Glass FACS tube | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Borosilicate glass tubes 12×75 mm |
| Flow Cytometer | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany | Fortessa II | Special Order |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, USA | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, USA | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germany | UV5TZ-400-15 | |
| Plexiglas tube 15 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 692215 | |
| PVC tile 5 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.005 | |
| PVC tile 6 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.006 | |
| PVC block 50 mm | Maertin; Freiburg, Germany | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoethanol | EMD; Germany | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germany | P30-3302 | |
| Penicillin/Strptomycin (10000 U/ml) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany | 15140-122 | |
| Acrifix plexiglas glue | Evonic industries, Essen, Germany | 1R0192 | |
| Tangit PVC-U glue | Henkel, Düsseldorf, Germany |
References
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time. Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).
- Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells. Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).
- Bugaj, L. J., et al. Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering. Nat Commun. 6, 6898 (2015).
- Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
- Taslimi, A., et al. An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function. Nat Commun. 5, 4925 (2014).
- Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics. Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).
- Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
- Wang, J., et al. Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).
- Wend, S., et al. Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells. ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).
- Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science. 338 (6108), 810-814 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).
- Brakemann, T., et al. A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching. Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).
