Extractie van Plant-gebaseerde Capsules voor Micro-inkapseling Applications
Summary
Dit protocol / manuscript beschrijft een gestroomlijnde werkwijze voor de productie van sporopollenin exine capsules (SEC) van Lycopodium clavatum sporen en voor het laden van hydrofiele stoffen in deze SEC.
Abstract
Microcapsules verkregen uit plantaardige sporen of pollen zorgen voor een robuust platform voor een breed scala aan micro-inkapseling toepassingen. Sporopollenin exine capsules (SEC) worden verkregen als sporen of pollen worden verwerkt teneinde de interne sporoplasmic inhoud te verwijderen. De verkregen holle microcapsules vertonen een hoge mate van uniformiteit en micromeritic behouden ingewikkelde microstructurele kenmerken in verband met de bepaalde plantensoort. Hierin tonen we een gestroomlijnde werkwijze voor de bereiding van SEC van Lycopodium clavatum sporen en voor het laden van hydrofiele stoffen in deze SEC. De huidige SEC isolatiewerkwijze is onlangs geoptimaliseerd om aanzienlijke vermindering van de verwerkingen die conventioneel worden toegepast in SEC isolatie, en de productie van intacte microcapsules waarborgen. Natuurlijke L. clavatum sporen worden ontvet met aceton, behandeld met fosforzuur, en grondig gewassen om sporoplasmi verwijderenc inhoud. Na ontvetting aceton, heeft één bewerkingsstap gebruikt 85% fosforzuur aangetoond dat alle sporoplasmic inhoud te verwijderen. Door de zure verwerkingstijd beperkt tot 30 uur, is het mogelijk om schone SEC isoleren en voorkomen SEC breken, waarvan is aangetoond dat optreedt met langere verwerkingstijd. Uitgebreid wassen met water, verdunde zuren, verdunde basen, oplosmiddelen en zorgt ervoor dat alle sporoplasmic materialen en chemische residuen adequate afvoer. Het vacuüm ladingstechniek wordt gebruikt om een model eiwit (runderserumalbumine) als representatieve hydrofiele verbinding laden. Vacuüm laden een eenvoudige techniek om verschillende verbindingen geladen zonder het gebruik van agressieve oplosmiddelen of ongewenste chemicaliën die vaak in andere micro protocollen vereist. Op basis van deze isolatie en laden protocollen SEC bieden een veelbelovend materiaal voor gebruik in een breed scala aan micro-inkapseling toepassingen, zoals geneesmiddelen, voedingsmiddelen, cosmetica en persoonlijke verzorging prodducten.
Introduction
Er is grote belangstelling in natuurlijke plantaardige capsules verkregen uit plantaardige sporen en pollen voor gebruik in micro-inkapseling toepassingen. 15/01 In de natuur, sporen en pollen bieden bescherming voor gevoelige genetisch materiaal tegen barre omstandigheden. De basisstructuur van plantaardige sporen en pollen omvat typisch een buitenste schillaag (exine), een binnenste bekledingslaag (intine) en de interne cytoplasmatische materiaal. De exine bestaat uit een chemisch robuust biopolymeer 1,9,10,13,16 genoemd sporopollenin en de intine bestaat voornamelijk uit cellulosematerialen. 16-18 lege capsules kunnen worden geïsoleerd door verscheidene werkwijzen 7,9 voor het verwijderen van materiaal cytoplasmatische , eiwitten, en de intine laag. 2,12,16 Deze sporopollenin exine capsules (SEC) een aantrekkelijk alternatief voor synthetische encapsulants vanwege hun nauwe grootteverdeling en uniforme morfologie. 7,9,13,19,20 Theontwikkeling van gestandaardiseerde processen SEC uit verschillende plantensoorten, zoals Lycopodium clavatum verkrijgen, opent het potentieel voor een breed scala aan micro-inkapseling toepassingen op het gebied van geneesmiddelafgifte, voedingsmiddelen en cosmetica. 6,10-13,21
Om SEC verkrijgen onderzoekers eerst behandeld sporen en pollen met organische oplosmiddelen en gerefluxt in alkalische oplossingen cytoplasmatische inhoud te verwijderen. 22-25 De resterende capsule structuur bepaald nog bevatten de celluloseachtige intine laag. Om deze te verwijderen, onderzoekers onderzocht het gebruik van verlengde zure hydrolyse bewerking met zoutzuur, zwavelzuur hete of warme fosforzuur gedurende meerdere dagen 22-25 met fosforzuur steeds de voorkeur van de SEC intine verwijderen. 2 De aanhoudende onderzoek door de jaren heen is gebleken dat verschillende sporen en pollen hebben verschillende mate van weerstand tegen de harde behandeling van methods vaak gebruikt. 26,27 Sommige sporen en pollen zijn volledig afgebroken en verliest alle structurele integriteit in sterk alkalische oplossingen, of worden zwaar beschadigd in sterk zure oplossingen. 16 De variabiliteit in de SEC-respons op de behandeling omstandigheden is het gevolg van subtiele variaties in de chemische structuur en morfologie van de exine sporopollenin exine materiaal tussen species. 28 Vanwege de variabiliteit in de robuustheid van sporopollenin exine capsules (SEC), moet de verwerkingsomstandigheden voor elke soort sporen en pollen optimaliseren.
Plant sporen van de soort L. clavatum hebben de meest bestudeerde enkele bron van de SEC worden. Voorgesteld wordt dat dit vooral te danken aan de ruime beschikbaarheid, lage kosten, monodispersiteit, en chemische robuustheid 9,29 De sporen kunnen eenvoudig worden geoogst en bevatten sporoplasmic inhoud in de vorm van groepen van 1 -. 2 pm celorganellen en biomolecules. 11 L. clavatum sporen zijn gebruikt als een natuurlijke poederlaag, 30,31 basis voor cosmetica, 30 en kruidengeneeskunde 32-36 voor uiteenlopende therapeutische toepassingen. De SEC verkregen uit L. clavatum is aangetoond veerkrachtiger te verwerken dan de SEC van andere soorten van sporen en pollen. 2 Na de verwerking te zijn, hebben de resulterende SEC is aangetoond dat hun ingewikkelde microridge structuren en hoge morfologische uniformiteit terwijl het verstrekken van een grote inwendige holte voor inkapseling te behouden. 7 studies tonen aan dat L. clavatum SEC kan worden gebruikt voor het inkapselen van geneesmiddelen, vaccins 10,13, 11 eiwitten, cellen 7,14, 8 oliën, 5-7,9 en voedingssupplementen. 5,15 Waargenomen SEC loading efficiëntie relatief hoog in vergelijking met conventionele inkapselingsmaterialen. 7 zijn een aantal gerapporteerde voordelenSEC inkapseling zoals de mogelijkheid om smaak te maskeren, 6,10 en een zekere mate van natuurlijke bescherming tegen oxidatie. 12 In de huidige studies, de meest gebruikte SEC extractiemethode voor L. clavatum is gebaseerd op vier belangrijke stappen. Stap men oplosmiddel terugvloeiing in aceton gedurende 12 uur bij 50 ° C om de sporen te ontvetten. 11 Stap twee alkalisch refluxen in 6% kaliumhydroxide gedurende 12 uur bij 120 ° C cytoplasma en eiwitachtige materialen te verwijderen. 11 Stap drie zuur refluxen in 85% fosforzuur tot 7 dagen bij 180 ° C aan de celluloseachtige intine te verwijderen. 11 Stap vier is een uitgebreid wassen met water, oplosmiddelen, zuren en basen alle resterende niet-exine materiaal te verwijderen en chemische residuen.
De belangrijkste doelstellingen van de SEC extractie ten opzichte van inkapseling toepassingen zijn om capsules die leeg van cytoplasmatische materiaal te produceren, vrij toevoegdem potentieel allergene eiwitten en morfologisch intact. 2,37 echter van fabricageprocessen perspectief is het ook belangrijk om extra economische en milieufactoren, zoals energiebesparing, duur productie, veiligheid en resulterende afval beschouwen. Met betrekking tot energie-efficiëntie, zowel hoge temperaturen en lange doorlooptijden van invloed op de productiekosten en ecologische voetafdruk. Productie duur en doorlooptijd zijn de belangrijkste factoren die van invloed verwerking winstgevendheid. Van bijzonder belang is dat hoge temperatuur fosforzuur verwerking verhoogt veiligheid en is bekend te resulteren in corrosieve schaling wat leidt tot een aanzienlijke stijging van onderhoud van de infrastructuur en vertragingen in batch doorlooptijden. 38-40 waar mogelijk, minimaliseert het aantal vereiste stappen kunnen leiden naar een forse verlaging van de geproduceerde afval. De gebruikte vier stappen L. clavatum SEC extractie moet gewoon evolved van tientallen jaren van onderzoek en heeft weinig feitelijke procesoptimalisatie gehad. Onlangs, Mundargi et al., 41 een belangrijke bijdrage aan de lopende werkzaamheden op dit gebied gemaakt door het systematisch evalueren en het optimaliseren van een van de meest gemelde SEC extractie technieken.
In het eerste deel van deze studie: spore ontvetting blijkt gebruikmaking aceton verwerking bij 50 ° C gedurende 6 uur; sporoplasm en intine verwijderingsprocedures gedemonstreerd gebruik 85% fosforzuur verwerking bij 70 ° C gedurende 30 uur; uitgebreid wassen met water, oplosmiddel, zuur en base wordt gebruikt om de verwijdering van resterende sporoplasmic inhoud tonen; SEC en drogen blijkt gebruikmaking convectie en gedroogd in de vacuümoven. In het derde deel wordt SEC vacuüm loading gedemonstreerd met gebruikmaking van vacuüm laden van een model eiwit, runderserumalbumine (BSA), gevolgd door BSA-beladen SEC wassen en vriesdrogen. In het vierde deel, de determinatie van de BSA inkapselingsefficiëntie blijkt gebruikmaking centrifugeren probe sonificatie en UV / VIS spectrometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk, een systematische analyse van de SEC extractie uit L. clavatum sporen wordt gepresenteerd en dit rapport toont aan dat het mogelijk is om een hogere kwaliteit capsules produceren voort als een belangrijke stroomlijning van de bestaande voorkomend protocol. 11 In tegenstelling tot de bestaande protocol die een hoge procestemperatuur (180 ° C) en lange procesduur (7 dagen), 11 de huidige SEC winning processing optimalisatie is primair gericht op het verlagen van de temperatuur …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).
Materials
| Lycopodium clavatum spores (s-type) | Sigma | 19108-500G-F | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | |
| FITC-conjugated BSA | Sigma | A9771-250MG | |
| Phosphoric acid (85 % w/v) | Sigma | 438081-2.5L | |
| Hydrochloric acid | Sigma | V800202 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-1KG | |
| Acetone | Sigma | V800022 | |
| Ethanol | AcME | C000356 | |
| Deionized water | Millipore purified water | ||
| Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose) | |||
| Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm) | Thermoscientific (CA, USA) | 4250A | |
| Vectashield | Vector labs (CA, USA) | H-1000 | |
| Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide | Ibidi GmbH (Munich, Germany) | 10812 | |
| Commercial Lycopodium SECs (L-type) | Polysciences, Inc. (PA, USA) | 16867-1 | |
| Heating plates | IKA, Germany | ||
| Scanning electron microscope | Jeol, Japan | JFC-1600 | |
| Elemental analyzer | Elementar, Germany | VarioEL III | |
| FlowCam: The benchtop system | Fluid Imaging Technologies, USA | FlowCamVS | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Germany | LSM710 | |
| Freeze dryer | Labconco, USA | ||
| UV Spectrometer | Boeco, Germany | S220 |
References
- Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17 (7), 609-612 (2007).
- Barrier, S. . Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. , (2008).
- Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Dosage Form. US Patent. , (2009).
- Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
- Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45 (7), 645-649 (2010).
- Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43 (1), 73-76 (2010).
- Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21 (4), 975-981 (2011).
- Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21 (44), 18018-18023 (2011).
- Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22 (19), 9767-9773 (2012).
- Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1 (5), 707-713 (2013).
- Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
- Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., Gaonkar, A. G. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. , 283-297 (2014).
- Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6 (1), 80-96 (2014).
- Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31 (7), 667-673 (2014).
- Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2 (8), 945-959 (2014).
- Southworth, D., et al., Blackmore, S., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. , 193-212 (2013).
- Stanley, R. G., Linskens, H. F. . Pollen: Biology, Biochemistry, Management. , 307 (1974).
- Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
- Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12 (9), 1167-1173 (2015).
- Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26 (4), 487-497 (2015).
- Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. , (2007).
- Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461 (1), 89-109 (1928).
- Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 517-519 (1931).
- Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 62-67 (1931).
- Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148 (9-10), 267-286 (1937).
- Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5 (2), 247-252 (1964).
- Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. , 16-22 (1966).
- Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12 (3), 171-178 (1999).
- Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
- Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109 (1), 146-150 (2007).
- Baytop, T. . Therapy with medicinal plants in Turkey. , 334-335 (1999).
- Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47 (7), 602-607 (2009).
- Ma, X., Gang, D. R. The lycopodium alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21 (6), 752-772 (2004).
- Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698 (1), 110-121 (2013).
- Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57 (3), 61-68 (2011).
- Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3 (1), 207-210 (2014).
- Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6 (20), 16533-16539 (2016).
- Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. , (2000).
- El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190 (1), 324-329 (2011).
- Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
- Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
- Smith, B. C. . Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , 182 (2011).
