Extraktion von Pflanzenbasis Kapseln für Mikroverkapselung Anwendungen
Summary
Dieses Protokoll / Manuskript beschreibt einen optimierten Prozess für die Herstellung von Sporopollenin exine Kapseln (SECs) von Keulen-Bärlapp – Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs.
Abstract
Mikrokapseln, die aus pflanzlicher Basis Sporen oder Pollen bieten eine robuste Plattform für ein breites Spektrum von Mikroverkapselung Anwendungen. Sporopollenin exine Kapseln (SECs) erhält, wenn Sporen und Pollen verarbeitet werden, um die interne sporoplasmic Inhalte zu entfernen. Die resultierenden hohlen Mikrokapseln mit einem hohen Grad an Micromeritic Einheitlichkeit aufweisen und komplizierte mikrostrukturellen Eigenschaften auf die besonderen Pflanzenarten im Zusammenhang behalten. Hier zeigen wir einen optimierten Prozess für die Herstellung von SECs von Keulen-Bärlapp – Sporen und für die Beladung von hydrophilen Verbindungen in diese SECs. Die aktuelle SEC Isolierungsverfahren wurde in SEC Isolations kürzlich optimiert, um signifikant die Verarbeitungsanforderungen zu reduzieren, die konventionell verwendet werden, und die Produktion von intakten Mikrokapseln zu gewährleisten. Natürliche L. clavatum Sporen werden mit Aceton entfettet, mit Phosphorsäure behandelt und extensiv sporoplasmi zu entfernen gewaschenc Inhalt. Nach Aceton Entfettung, alle sporoplasmic einen einzigen Schritt Verarbeitung 85% unter Verwendung von Phosphorsäure gezeigt Inhalte zu entfernen ist. Durch die Begrenzung der Säurebearbeitungszeit auf 30 Stunden, ist es möglich, saubere SECs zu isolieren und SEC Fracturing vermeiden, die gezeigt worden ist, mit einer verlängerten Verarbeitungszeit auftreten. Ausgiebiges Waschen mit Wasser, verdünnte Säuren, verdünnte Basen und Lösungsmittel sichergestellt, dass alle sporoplasmic Material und chemische Rückstände ausreichend entfernt werden. Die Vakuumbeladungstechnik wird verwendet, um ein Modellprotein (Rinderserumalbumin) als repräsentative hydrophile Verbindung zu laden. Vakuumbelastung stellt eine einfache Technik verschiedene Verbindungen ohne die Notwendigkeit einer scharfen Lösungsmittel oder unerwünschte Chemikalien zu laden, die oft in anderen Mikroverkapselung Protokolle erforderlich sind. Auf der Grundlage dieser Isolation und Belastungsprotokollen bieten SECs ein vielversprechendes Material für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Mikroverkapselung-Anwendungen, wie Therapeutika, Lebensmittel, Kosmetika und Körperpflege proddukten.
Introduction
Es gibt großes Interesse an natürlichen Pflanzenbasis Kapseln aus Pflanzensporen und Pollen für die Verwendung in der Mikroverkapselung Anwendungen erhalten. 1-15 In der Natur, Sporen und Pollen Schutz für empfindliche genetische Materialien gegen raue Umgebungsbedingungen. Die Grundstruktur der Pflanzensporen und Pollen umfasst typischerweise eine äußere Hüllschicht (exine), eine innere Mantelschicht (intine) und die interne zytoplasmatische Material. Die exine besteht aus einem chemisch robust Biopolymer 1,9,10,13,16 bezeichnet als Sporopollenin und die intine besteht hauptsächlich aus cellulosischen Materialien besteht. 16-18 leeren Kapseln kann nach verschiedenen Verfahren zur Entfernung von 7,9 cytoplasmatische Material isoliert werden , Proteine und die intine Schicht. 2,12,16 Diese Sporopollenin exine Kapseln (SECs) eine überzeugende Alternative zu synthetischen Vergussmassen bieten aufgrund ihrer engen Größenverteilung und eine einheitliche Morphologie. 7,9,13,19,20 dieEntwicklung von standardisierten Prozessen SECs aus verschiedenen Pflanzenarten, wie Lycopodium clavatum zu erhalten, öffnet sich das Potential für eine breite Palette von Mikroverkapselung Anwendungen auf den Gebieten der Arzneimittelabgabe, Nahrungsmittel und Kosmetika. 6,10-13,21
Um SECs zu erhalten, zytoplasmatische Inhalte zu entfernen , Sporen und Pollen mit organischen Lösungsmitteln und unter Rückfluß erhitzt in alkalischen Lösungen behandelt Forscher zuerst. 22-25 jedoch wurde die verbleibende Kapselstruktur des Cellulose intine Schicht enthalten noch bestimmt. Um diese zu entfernen, erkundeten die Forscher die Verwendung von längeren saure Hydrolyse Verarbeitung Salzsäure, heißer Schwefelsäure oder heiße Phosphorsäure über mehrere Tage mit, 22-25 mit Phosphorsäure die bevorzugte Methode der SEC intine Entfernung zu werden. 2 jedoch laufend Forschung in den letzten Jahren hat gezeigt, dass verschiedene Sporen und Pollen haben unterschiedliche Grade der Widerstandsfähigkeit gegenüber der harten Verarbeitung michthoden verwendet. 26,27 Einige Sporen und Pollen vollständig abgebaut sind und alle strukturelle Integrität in stark alkalischen Lösungen zu verlieren, oder stark in stark sauren Lösungen beschädigt werden. 16 Die Variabilität in SEC als Reaktion auf die Behandlungsbedingungen ist aufgrund subtile Variationen in der chemischen Struktur und Morphologie des exine Sporopollenin exine Material zwischen den Arten. 28 Aufgrund der Variabilität in der Robustheit Sporopollenin exine Kapseln (Sekunden), ist es notwendig , die Verarbeitungsbedingungen für die einzelnen Arten von sporen und Pollen zu optimieren.
Pflanzensporen aus der Spezies L. clavatum haben die am häufigsten untersuchten einzelne Quelle von SECs werden. Es wird vorgeschlagen , dass dies in erster Linie wegen seiner breiten Verfügbarkeit ist, niedrige Kosten, Monodispersität und chemische Robustheit 9,29 Die Sporen leicht geerntet werden können und enthalten sporoplasmic Inhalte in Form von Gruppen von 1 -. 2 um Zellorganellen und biomolecules. 11 L. clavatum Sporen wurden als natürliches Pulverschmiermittel, 30,31 Basis für Kosmetika, 30 und in der Kräutermedizin 32-36 für eine breite Palette von therapeutischen Anwendungen eingesetzt. Die SECs von L. erhalten clavatum wurden zur Verkapselung gezeigt werden , widerstandsfähiger Verarbeitung als SECs aus anderen Arten von Sporen und Pollen. 2 Nach der Bearbeitung wurden die resultierenden SECs worden ihre komplizierten microridge Strukturen und hohe morphologische Homogenität gezeigt zu halten , während eine große innere Hohlraum bereitstellt. 7 Studien zeigen , dass L. clavatum SECs kann zur Verkapselung von Arzneimitteln, Impfstoffen 10,13, 11 – Proteine, 7,14 Zellen, 8 Öle, 5-7,9 und Nahrungsergänzungsmittel. 5,15 Beobachteter SEC Ladewirkungsgrade sind relativ hoch im Vergleich zu herkömmlichen verwendet werden , Verkapselungsmaterialien. 7 Es gibt auch eine Reihe von Vorteilen berichtetDas am häufigsten verwendete SEC Extraktionsverfahren für L. SEC Einkapselung wie die Fähigkeit , Geschmack zu maskieren, 6,10 und einen gewissen Grad an natürlicher Schutz gegen Oxidation zu sorgen. 12 in den vorliegenden Studien, clavatum basiert auf vier Hauptschritte. Schritt eins ist Lösungsmittel Rückflußkochen in Aceton bis zu 12 Stunden bei 50 ° C , um die Sporen zu entfetten. 11 Schritt zwei alkalisch Rückfluß in 6% Kaliumhydroxid für bis zu 12 h bei 120 ° C zytoplasmatischen und proteinöse Materialien zu entfernen. 11 Stufe drei ist Säure Rückfluss in 85% iger Phosphorsäure für bis zu 7 Tage bei 180 ° C , um die Cellulose – intine Material zu entfernen. 11 Schritt vier ist ein umfassendes Waschvorgang Wasser, Lösungsmittel, Säuren und Basen alle verbleibenden nicht exine Material zu entfernen und chemische Rückstände.
Die Hauptziele der SEC-Extraktion in Bezug auf Verkapselungsanwendungen sind Kapseln zu produzieren, die leeren zytoplasmatischer Material, frei from potenziell allergene Proteine und morphologisch intakt. 2,37 jedoch von einem industriellen Fertigungs Sicht ist es auch wichtig ist , weitere wirtschaftliche und ökologische Faktoren wie Energieeffizienz, Produktionsdauer, Sicherheit, und die daraus resultierenden Abfall zu betrachten. Im Hinblick auf die Energieeffizienz, sowohl bei hohen Temperaturen und lange Bearbeitungszeiten beeinflussen die Produktionskosten sowie Umweltbelastung. Produktionsdauer und Laufzeit sind wichtige Faktoren, die die Verarbeitung der Rentabilität. Besonders besorgniserregend ist , dass Hochtemperatur – Sicherheitsfragen Phosphorsäure Verarbeitung erhöht und wird in korrosiven Skalierung führen bekannt , die in die Instandhaltung der Infrastruktur und Verzögerungen bei der Batch – Laufzeiten zu einem signifikanten Anstieg führt. 38-40 Wo es möglich ist , die Minimierung der Anzahl der erforderlichen Schritte führen kann deutlich den produzierten Abfall zu reduzieren. Jedoch verwendet das allgemein vierstufigen Prozess von L. clavatum SEC Extraktion hat einfach evolved aus Jahrzehnten der Forschung und hat wenig tatsächlichen Prozessoptimierung hatte. Vor kurzem Mundargi et al., Machte 41 einen wesentlichen Beitrag zu den laufenden Arbeiten in diesem Bereich durch die systematische Auswertung und eines der am häufigsten berichteten SEC Extraktionstechniken zu optimieren.
Im ersten Abschnitt dieser Studie: Sporen Entfettung wird 6 h bei 50 ° C unter Verwendung von Aceton-Verarbeitung gezeigt; sporoplasm und intine Abschiebungsverfahren demonstriert für 30 Stunden bei 70 ° C 85% ige Phosphorsäure Verarbeitung verwendet wird; ausgiebiges Waschen mit Wasser, Lösemittel, Säure und Base wird verwendet, um die Entfernung von restlichem sporoplasmic Inhalte zu zeigen; und SEC Trocknung wird gezeigt, unter Verwendung von Konvektion Trocknen und Vakuumofentrocknung. Im dritten Abschnitt wird SEC Vakuumlade Vakuum Laden eines Modellproteins demonstrierte Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA), gefolgt von BSA-geladen-SEC Waschen und Lyophilisieren. Im vierten Abschnitt wird die determination des Wirkungsgrades BSA Verkapselung Zentrifugation demonstrierte Verwendung Sondenbeschallung und UV / Vis-Spektrometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit wird eine systematische Analyse der SEC – Extraktion aus L. clavatum Sporen präsentiert und dieser Bericht zeigt , dass es möglich ist , eine höhere Qualität Kapseln zu produzieren , während auch eine deutliche Straffung der vorbestehenden häufigsten verwendete Protokoll zu erreichen. 11 Im Gegensatz zu dem bestehenden Protokoll eine hohe Prozesstemperatur erforderlich ist (180 ° C) und eine lange Prozessdauer (7 Tage), 11 die aktuelle Optimierungs wurde SEC – Extra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) and the National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).
Materials
| Lycopodium clavatum spores (s-type) | Sigma | 19108-500G-F | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | |
| FITC-conjugated BSA | Sigma | A9771-250MG | |
| Phosphoric acid (85 % w/v) | Sigma | 438081-2.5L | |
| Hydrochloric acid | Sigma | V800202 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-1KG | |
| Acetone | Sigma | V800022 | |
| Ethanol | AcME | C000356 | |
| Deionized water | Millipore purified water | ||
| Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose) | |||
| Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm) | Thermoscientific (CA, USA) | 4250A | |
| Vectashield | Vector labs (CA, USA) | H-1000 | |
| Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide | Ibidi GmbH (Munich, Germany) | 10812 | |
| Commercial Lycopodium SECs (L-type) | Polysciences, Inc. (PA, USA) | 16867-1 | |
| Heating plates | IKA, Germany | ||
| Scanning electron microscope | Jeol, Japan | JFC-1600 | |
| Elemental analyzer | Elementar, Germany | VarioEL III | |
| FlowCam: The benchtop system | Fluid Imaging Technologies, USA | FlowCamVS | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Germany | LSM710 | |
| Freeze dryer | Labconco, USA | ||
| UV Spectrometer | Boeco, Germany | S220 |
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