Las cápsulas de origen vegetal extracción de microencapsulación para Aplicaciones

Summary

Este protocolo / manuscrito describe un proceso simplificado para la producción de cápsulas exina sporopollenin (segundos) de las esporas de Lycopodium clavatum y para la carga de compuestos hidrófilos en estos SEC.

Abstract

Las microcápsulas derivadas de esporas o polen de origen vegetal proporcionan una plataforma sólida para una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación. cápsulas sporopollenin exina (segundos) se obtienen cuando las esporas o polen son procesadas a fin de eliminar el contenido sporoplasmic internos. Las microcápsulas huecas resultantes exhiben un alto grado de uniformidad micromeritic y conservan características microestructurales intrincados relacionados con las especies de plantas particulares. En este documento, se demuestra un proceso simplificado para la producción de los CEE a partir de esporas clavatum Lycopodium y para la carga de compuestos hidrófilos en estos SEC. El procedimiento actual aislamiento SEC ha sido optimizado recientemente para reducir significativamente los requisitos de transformación que se usan convencionalmente en el aislamiento de la SEC, y para asegurar la producción de microcápsulas intactas. L. Natural esporas clavatum se desgrasados con acetona, se trató con ácido fosfórico, y extensamente lavadas para eliminar sporoplasmicontenido c. Después de desgrase acetona, un solo paso de procesamiento utilizando ácido fosfórico al 85% se ha demostrado para eliminar todos los contenidos sporoplasmic. Al limitar el tiempo de procesamiento de ácido a 30 hr, es posible aislar SEC limpias y evitar SEC fracturación, que se ha demostrado que se producen con el tiempo de procesamiento prolongado. Lavado extensivo con agua, ácidos diluidos, diluir bases, y disolventes asegura que todos los residuos de material y químicas sporoplasmic se eliminan adecuadamente. La técnica de carga de vacío se utiliza para cargar una proteína modelo (albúmina de suero bovino) como un compuesto hidrófilo representante. carga de vacío proporciona una técnica sencilla para cargar varios compuestos sin la necesidad de disolventes agresivos o productos químicos indeseables que a menudo se requieren en otros protocolos de microencapsulación. Sobre la base de estos protocolos de aislamiento y de carga, SEC proporcionar un material prometedor para su uso en una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación, como por ejemplo, terapéutica, alimentos, cosméticos, cuidado personal y prodductos.

Introduction

Existe un interés significativo en cápsulas a base de plantas naturales obtenidos a partir de las esporas y el polen de las plantas para uso en aplicaciones de microencapsulación. ^1-15 En la naturaleza, las esporas y el polen proporcionan protección para materiales genéticos sensibles contra condiciones ambientales duras. La estructura básica de las esporas de plantas y polen comprende típicamente una capa externa shell (exina), una capa envolvente interior (intine), y el material citoplásmica interna. La exina se compone de una químicamente robusto biopolímero ^1,9,10,13,16 referido como sporopollenin y de la intine se compone principalmente de materiales celulósicos. ^16-18 cápsulas vacías se pueden aislar mediante diversos procesos de ^7,9 para la eliminación de material citoplásmico , proteínas, y la capa intine. ^2,12,16 Estas cápsulas exina sporopollenin (SEC) proporcionan una alternativa atractiva a los encapsulantes sintéticas debido a su estrecha distribución de tamaño y morfología uniforme. ^7,9,13,19,20 eldesarrollo de procesos estandarizados para obtener SEC de diversas especies de plantas, tales como Lycopodium clavatum, se abre la posibilidad de una amplia gama de aplicaciones de microencapsulación en los campos de la administración de fármacos, alimentos y cosméticos. ^6,10-13,21

Con el fin de obtener SEC, los investigadores trataron primero esporas y el polen con disolventes orgánicos y calentó a reflujo en soluciones alcalinas para eliminar contenido citoplásmico. ^22-25 Sin embargo, se determinó la estructura de cápsula restante todavía contienen la capa intine celulósico. Para eliminar esto, los investigadores exploraron el uso del procesamiento de la hidrólisis ácida prolongado con ácido clorhídrico, ácido sulfúrico caliente, o ácido fosfórico caliente durante varios días, ^22-25 con ácido fosfórico convertirse en el método preferido de eliminación intine SEC. ² Sin embargo, en curso la investigación en los últimos años ha demostrado que varias esporas y pólenes tienen diferentes grados de firmeza frente a la dura conmigo procesamientothods comúnmente utilizado. ^26,27 Algunas esporas y el polen son completamente degradados y pierden toda la integridad estructural en soluciones alcalinas fuertes, o se vuelven fuertemente dañado de fuertes soluciones ácidas. ¹⁶ La variabilidad en la respuesta a SEC condiciones de tratamiento es debido a las variaciones sutiles en el producto químico la estructura y la morfología del material exina sporopollenin exina entre las especies. ²⁸ Debido a la variabilidad en la robustez de cápsulas exina sporopollenin (segundos), es necesario optimizar las condiciones de transformación para cada especie de esporas y el polen.

Esporas de plantas de la especie L. Clavatum se han convertido en la fuente más ampliamente estudiado de la SEC. Se propone que esto es principalmente debido a su amplia disponibilidad, bajo coste, monodispersividad, química y robustez ^9,29 Las esporas pueden ser fácilmente cosechada y contiene contenidos sporoplasmic en forma de agrupaciones de 1 -. 2 micras orgánulos celulares y biomolecules. ¹¹ L. esporas clavatum se han utilizado como un lubricante en polvo natural, ^30,31 una base para cosméticos, ³⁰ y ^{32 a 36} en la medicina herbal para una amplia gama de aplicaciones terapéuticas. Las SEC obtenidos de L. clavatum han demostrado ser más resistentes al procesamiento de SEC de otras especies de esporas y el polen. ² Después del procesamiento, las SEC resultantes se han demostrado para conservar sus estructuras microridge intrincados y alta uniformidad morfológica mientras que proporciona una gran cavidad interna para la encapsulación. ⁷ Los estudios indican que L. SEC clavatum se pueden utilizar para la encapsulación de medicamentos, vacunas, ^{10,13 11} proteínas, células, ^{7,14 8} aceites, ^5-7,9 y suplementos alimenticios. ^5,15 observados eficiencias de carga de la SEC son relativamente altos en comparación con los convencionales encapsulación de materiales. ⁷ también hay una serie de beneficios reportadosa SEC encapsulación tales como la capacidad de enmascarar sabores, ^6,10 y para proporcionar algún grado de protección natural contra la oxidación. ¹² En los estudios existentes, el método de extracción más utilizada SEC para L. Clavatum se basa en cuatro pasos principales. El primer paso es de reflujo del disolvente en acetona durante un máximo de 12 horas a 50 ° C para desecar las esporas. ¹¹ El segundo paso es el reflujo alcalino en hidróxido de potasio al 6% para un máximo de 12 horas a 120 ° C para eliminar citoplasmática y materiales proteicos. ¹¹ Paso tres es el reflujo ácido en ácido fosfórico al 85% durante un máximo de 7 días a 180 ° C para eliminar el material intine celulósico. ¹¹ el cuarto paso es un proceso exhaustivo lavado usando agua, disolventes, ácidos y bases para eliminar todo el material no exina restante y residuos químicos.

Los principales objetivos de la extracción de la SEC en relación con las aplicaciones de encapsulación son para producir cápsulas que están vacías de material citoplasmático, libre de aquí para alláproteínas M potencialmente alergénicos, y morfológicamente intactos. ^2,37 Sin embargo, desde una perspectiva de fabricación industrial, también es importante tener en cuenta factores económicos y ambientales adicionales, tales como, la eficiencia energética, la duración de producción, seguridad, y los residuos resultantes. Con respecto a la eficiencia energética, tanto en altas temperaturas y largos tiempos de procesamiento afectan a los costes de producción, así como el impacto medioambiental. duración de la producción y el tiempo de respuesta son factores clave que influyen en la rentabilidad de procesamiento. De particular preocupación es que el procesamiento de ácido fosfórico de alta temperatura aumenta los problemas de seguridad y es conocido por producir incrustaciones corrosivo que conduce a un aumento significativo en el mantenimiento de infraestructuras y los retrasos en los tiempos de respuesta por lotes. ^38-40 Siempre que sea posible, reduciendo al mínimo el número de pasos necesarios puede conducir a reducir significativamente los residuos producidos. Sin embargo, el comúnmente utilizado proceso de cuatro pasos de L. extracción Clavatum SEC tiene simplemente evolved de décadas de investigación y ha tenido poco optimización del proceso real. Recientemente, Mundargi et al., ⁴¹ hizo una importante contribución a la labor en curso en este campo mediante la evaluación y optimización de una de las técnicas de extracción de la SEC con mayor frecuencia de forma sistemática.

En la primera sección de este estudio: pérdida de grasa de esporas se demuestra la utilización de procesamiento de acetona a 50 ° C durante 6 horas; procedimientos esporoplasma y de eliminación de intine se demuestran la utilización de procesamiento de ácido fosfórico 85% a 70 ° C durante 30 h; extenso lavado con agua, disolventes, ácido y la base se utiliza para demostrar la eliminación de contenidos sporoplasmic residuales; y SEC secado se demuestra utilizando secado por convección y secado en horno de vacío. En la tercera sección, SEC carga de vacío se demuestra utilizando la carga de vacío de una proteína modelo, la albúmina de suero bovino (BSA), seguido de BSA-carga-SEC lavado y liofilización. En la cuarta sección, el deteración de la eficiencia de encapsulación de BSA se demuestra utilizando la centrifugación, la sonda de ultrasonidos, rayos UV y Vis / espectrometría.

Protocol

1. Extracción de sporopollenin exina Cápsulas (SEC) de L. Las esporas clavatum Nota: El proceso de extracción SEC implica un polvo inflamable (L. Clavatum), ácidos corrosivos calientes y disolventes inflamables, por lo tanto, el equipo de protección personal adecuado (gafas, mascarilla, guantes, bata de laboratorio), la evaluación de riesgos aprobado el uso y disposición de productos químicos autorizados por el personal de laboratorio es esencial. Spore Desen…

Representative Results

Proceso de extracción optimizada para sporopollenin exina Cápsulas El L. extracción clavatum SEC se logró mediante tres pasos principales: (1) degradación de grasa usando acetona; (2) La acidolisis usando ácido fosfórico al 85% (v / v); y (3) Amplia lavado SEC uso de disolventes. El flujo del proceso de extracción SEC simplificado se presenta en la Figura 1 A -. I Bre…

Discussion

En este trabajo, un análisis sistemático de la extracción de la SEC L. esporas clavatum se presenta y este informe muestra que es posible producir cápsulas de mayor calidad mientras que también el logro de una simplificación significativa de la pre-existente protocolo utilizado comúnmente. ¹¹ En contraste con el protocolo existente que requiere una alta temperatura del proceso (180 ° C) y una larga duración del proceso (7 días), ¹¹ la corriente de la optimización de pro…

Materials

Lycopodium clavatum spores (s-type)	Sigma	19108-500G-F
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G
FITC-conjugated BSA	Sigma	A9771-250MG
Phosphoric acid (85 % w/v)	Sigma	438081-2.5L
Hydrochloric acid	Sigma	V800202
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-1KG
Acetone	Sigma	V800022
Ethanol	AcME	C000356
Deionized water	Millipore purified water
Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose)
Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm)	Thermoscientific (CA, USA)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide	Ibidi GmbH (Munich, Germany)	10812
Commercial Lycopodium SECs (L-type)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Heating plates	IKA, Germany
Scanning electron microscope	Jeol, Japan	JFC-1600
Elemental analyzer	Elementar, Germany	VarioEL III
FlowCam: The benchtop system	Fluid Imaging Technologies, USA	FlowCamVS
Confocal laser scanning microscope	Carl Zeiss, Germany	LSM710
Freeze dryer	Labconco, USA
UV Spectrometer	Boeco, Germany	S220