Abstract
体外整合膜蛋白的研究经常由疏水跨膜结构域的存在复杂。这些研究进一步复杂化，洗涤剂溶解的膜蛋白的重新纳入到脂质体是一种随机过程，其中蛋白质拓扑是无法执行。本文提供了一种替代方法，它利用基于脂质体的脚手架这些具有挑战性的技术。蛋白质溶解度是由跨膜结构域的缺失增强，并且这些氨基酸与一个系栓部分取代，如His标签。此系链与，这在脂质体的表面实施均匀的蛋白质拓扑结构（由次氮基三乙酸（NTA（镍2+））为His-标记的蛋白的协调的Ni 2+）的锚定基团相互作用。一个例子给出，其中用完整的膜蛋白，线粒体裂变因子（MFF）动力素相关蛋白1（DRP1）之间的相互作用，是英伟使用这种支架脂质体法stigated。在这项工作中，我们已经证明MFF的有效招募可溶性DRP1到脂质体的表面上，这刺激其GTP酶活性的能力。此外，DRP1能够tubulate在特定脂质的存在下MFF装饰脂质模板。本实施例说明采用结构和功能分析的脂质体的支架的有效性，并突出MFF在调节DRP1活性的作用。
Introduction
研究膜近端蛋白质-蛋白质相互作用是一个具有挑战性的努力由于在扼要涉及1的整合膜蛋白的天然环境中的困难。这是由于洗涤剂增溶的必要性和蛋白在脂蛋白体不一致取向。为了避免这些问题，我们采用的策略，从而整合膜蛋白的可溶性结构域被表达为His-标签的融合蛋白质，以及这些的可溶性片段在脂质经由相互作用锚定到支架的脂质体与NTA（镍2+）首基表面。使用这些支架，脂质 - 近侧蛋白质相互作用可以在一定范围内的脂质和蛋白质的组合物进行研究。
我们已经有效地应用这种方法来调查支配线粒体裂变复杂的装配关键蛋白 - 蛋白相互作用并检查调节这种公关脂相互作用ocess 2。期间线粒体裂变，一个保守的膜重塑的蛋白质，称为动力素相关蛋白1（DRP1）3，响应于调节能量平衡，凋亡信号等几个蜂窝信号募集至线粒体外膜（OMM）的表面整体线粒体的过程。 8 -这个大，胞浆GTP酶是通过与不可分割的OMM蛋白4次互动招募到线粒体的表面。一个这样的蛋白质的作用，线粒体裂变因子（MFF），一直难以阐明由于在体外用DRP1表观弱相互作用。然而，遗传研究清楚地表明，MFF是成功的线粒体分裂7,8至关重要。在这个手稿中描述的方法能够通过引入促进DRP1-MFF相互作用同时脂质相互作用克服了以前的缺点。总体而言，这一新的分析revea导致基本相互作用指导线粒体分裂复杂的装配和这一重要分子机器正在进行的结构和功能研究提供了一个新的阶段。
迄今为止，DRP1以及MFF之间的相互作用的研究已经通过MFF 9固有的灵活性复杂，DRP1的异质性聚合物2,10，并且难以纯化和重建全长MFF具有完整跨膜结构域11。我们通过使用NTA（镍离子 ）支架脂质体重组His标记的MFF缺乏跨膜结构域（MffΔTM-他6）解决了这些难题。这一战略是有利的，因为MffΔTM是非常易溶当E的表达。大肠杆菌 ，这种分离蛋白很容易在支架脂质体重组。当拴这些脂质模板，MFF假定在膜的表面上的相同的，面向外的取向。除了这些优点，线粒体脂质，如心磷脂，分别加入稳定MFF折叠和关联与膜11。心磷脂也与DRP1 2,12的可变结构域可稳定这种无序区和促进裂变机械的组件交互。
这种稳健的方法可广泛应用于未来的研究，设法评估近膜蛋白相互作用。通过使用附加的系链/亲和力的相互作用，这些膜重建研究的复杂性可以提高，以模仿附加在细胞内的膜的表面发现的复杂性。与此同时，脂质组合物可以被修改以更准确地模仿这些大分子复合的天然环境。总之，这种方法提供了研究蛋白质的关键的细胞PROC中的相对贡献和脂类塑造膜形态为手段S弯。
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Protocol
1.脚手架脂质体制剂
注：在理想情况下，最初的实验应该使用一个相对简单的和特征的支架（包括DOPC（1,2- dioleoyl- SN -glycero -3-磷酸胆碱或PC）和DGS-NTA（镍2+）（1,2-二油酰基的- SN -glycero -3 - [（N - （5-氨基-1-羧基戊基）亚氨基二乙酸）琥珀酰基]（镍盐））建筑物关闭这些实验中，脂质电荷，柔韧性，和曲率可以引入作为单独因素同的电位，以改变膜近端相互作用。这些改变可以通过添加规定量的特定的脂质成分，包括磷脂酰丝氨酸或心磷脂（CL），磷脂酰乙醇胺（DOPE或PE），或半乳糖（β）神经酰胺来实现。
- 结合溶于氯仿在一个干净的玻璃试管脂质。同时旋转该管以形成薄脂质膜蒸发用干燥氮气除去溶剂。用centrifuga除去残留溶剂升蒸发器在37℃1小时。
注：各种脂质体制剂是在协议中使用如下所述：支架脂质体（3.3％（摩尔）DGS-NTA（镍离子 ）/ 96.7％摩尔DOPC），与心磷脂脂质体支架（3.3％（摩尔）DGS-NTA（镍离子 ） / 10％（摩尔）心磷脂/ 86.7％摩尔DOPC），灵活的支架与脂质体心磷脂（3.3％（摩尔）DGS-NTA（镍离子 ）/ 10％（摩尔）心磷脂/ 35％（摩尔）DOPE / 51.7％摩尔DOPC），以及丰富的脚手架脂质体（10％摩尔DGS-NTA（镍离子 ）/ 15％（摩尔）心磷脂/ 35％（摩尔）DOPE / 40％摩尔DOPC）。 - 添加预热至37℃的缓冲液A（25mM的HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸），150毫米氯化钾，pH值调节至7.5，用KOH），使得最终的脂质浓度为1 - 2毫米。孵育30分钟，在37℃偶尔涡旋充分悬浮的脂质混合物（ 图1a）。
- 转移到塑料试管，将管在液氮中，直到完全冻结（roug溶血素30秒），并在37℃水浴直至完全解冻（约1处 - 2分钟）。重复，共4次冻融循环（ 图1b）。
- 浸泡4滤波器支持和在缓冲液中的聚碳酸酯过滤器，并根据制造商的说明书组装挤出制备的脂质挤出机。通过过滤器21次挤出脂质溶液。使用温和，恒定压力，以确保均匀的尺寸分布（ 图1c）。
注：在本协议中所描述的所有实验中，用于挤出一个1.0微米的聚碳酸酯滤器。可与各种脂质体的直径为50至400nm 12或更大13的观察与阴离子脂质DRP1相互作用。因此，1微米的过滤器的尺寸选择为理想为GTP酶的活性和电子显微镜。如果其他脂质体直径的需要，在制备巨头单层脂质体14,15（GUVs）或小unilamell的芳囊泡16（越野车）都可以使用。动态光散射可以用于评估脂质体大小异质13。 - 在4℃保存挤出脂质体和后3丢弃 - 5 D。
2.蛋白结合分析使用脚手架的脂质体
- 样品制备
- 孵育His-标记MffΔTM（5μM终浓度）与骨架的脂质体（40％（摩尔）的PC / 35摩尔％的PE / 15摩尔％的CL / 10摩尔％的DGS-NTA（镍2+）;50μM的最终）为至少15分钟在RT缓冲液A + BME（25毫米的HEPES，150mM的氯化钾，10mM的β巯基乙醇（BME），pH值调节至7.5，用KOH）。对于MFF的自由控制，孵化用他的标记对照蛋白（如GFP）来绑定和盾暴露NTA（镍离子 ）的脂质体。
注：MffΔTM表达和纯化如在先前的研究2中所描述。绿色荧光蛋白以相似的方式进行纯化，但是省略了离子交换步骤。 BME被要求为这些experimenTS因为DRP1是氧化，其可以改变其活性和装配性能敏感。 - 添加DRP1（2μM最终），并在室温下孵育1小时。
注：DRP1表达和纯化如在先前的研究2中所描述。与DRP1孵育后，核苷酸对膜变形结合的效果可通过温育一个附加小时了2mM的MgCl 2和任一1mM的GTP，1mM的GMP-PCP，或缓冲液A + BME进行调查。
- 孵育His-标记MffΔTM（5μM终浓度）与骨架的脂质体（40％（摩尔）的PC / 35摩尔％的PE / 15摩尔％的CL / 10摩尔％的DGS-NTA（镍2+）;50μM的最终）为至少15分钟在RT缓冲液A + BME（25毫米的HEPES，150mM的氯化钾，10mM的β巯基乙醇（BME），pH值调节至7.5，用KOH）。对于MFF的自由控制，孵化用他的标记对照蛋白（如GFP）来绑定和盾暴露NTA（镍离子 ）的脂质体。
- 负染色透射电子显微镜（EM）的分析
- 转移5μL的样品的实验室膜的片，并放置在样品上的碳涂层Cu /铑网格。孵育样品上的栅极1分钟，吸干远在滤纸上多余的液体，并转移到2％乙酸双氧铀的下降。孵育1分钟，吸干滤纸上过量染色，并转移到网格框。在真空条件下O / N商店，以确保完全干燥。
- 使用透射电子microsc图像样本OPE 18,500 - 30,000X放大观察的蛋白质和脂质体形态17超微结构的改变。
注：超微结构的改变可以通过图像分析软件进行量化，如ImageJ的13（http://imagej.nih.gov/ij/）。蛋白质装修时，可以用肉眼脂模板相比，来衡量。另外，管状段的直径可以从组件13的最外部分来测量。可使用低温电子显微镜17进行更为详细的分析。这种方法可用于图像天然蛋白质 - 类脂组件在溶剂而不使用重金属污渍的涂层样品。以这种方式，详细的结构特征在负染色，包括在底层脂质形态的改变并不明显，可以检查和定量。
3.使用脚手架脂质体对酶法测定
注意：COLORI公制GTP酶测定18用于测量通过GTP水解磷酸解放。替代GTP酶测定法是可用的19，并且可以根据需要来实现。
- 孵育他的标记MffΔTM（MFF），Fis1ΔTM（FIS1）或GFP（5微米决赛全部）配有支架脂质体（150μM最终）在RT在缓冲液A + BME（体积= 30μL）15分钟。添加DRP1（500nM终），并在RT（体积= 80微升）孵育另外的15分钟。
注：FIS1被以类似的方式向MFF 2纯化，但是省略了离子交换层析步骤。 His标记的GFP的目的是屏蔽NTA（镍2+）头部基团，并防止与其他蛋白质的非特异性电荷相互作用。如果没有效果是在不存在的GFP观察到的，则该控制可能不需要。替代阻断蛋白质（的大小相当于感兴趣的蛋白）可以使用为好，但绿色荧光蛋白允许与SCAF的相互作用的直接可视化折叠脂质体。 - 传输管以热循环设置为37℃，并开始通过加入GTP和的 MgCl 2反应（1分别毫和2mM终;体积= 120微升）。
- 在所需的时间点（ 即 T = 5，10，20，40，60分钟），转移反应的20微升含0.5M的EDTA 5微升以螯合镁离子和停止反应微量滴定板的孔中。
- 在缓冲区A + BME稀释KH 2 PO 4校准结果准备一套磷酸标准。的标准的一个组有用是100，80，60，40，20，10，5，和0微米。添加各20μL的于含0.5M的EDTA 5微升孔中。
- 添加150孔雀石μL的绿色试剂（1毫孔雀绿甲醇，10毫钼酸铵四水合物，和1N HCl中）到每个孔中，并读取OD加入后650 5分钟。
注：GTP是酸不稳定的，并且将在孔雀绿试剂的存在下水解。可以保证T他补充孔雀石试剂和阅读之间的时间是恒定的，以确保可重复的结果。 - 产生通过绘制标准的OD 650作为磷酸盐浓度的函数的标准曲线。使用线性回归来确定样品中的OD 650和磷酸盐浓度之间的关系。
- 使用线性回归，转换蛋白反应样品的OD 650μM磷酸盐。通过标绘磷酸盐浓度作为时间的函数确定磷酸盐一代的各反应混合物中的速率，并转换由DRP1浓度（0.5μM）除以速率为k 猫 。
注意：只有在初始线性速率应被用来确定磷酸产生的速率，并且必须使用至少3个数据点。如果反应的速率足够快，以致前三个数据点不是线性的（ 即线性拟合的R 2是小于0.9）的标志应进行至少3个时间点ificantly较短的时间过程。
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Representative Results
而DRP1和MFF之间的相互作用已被证明是线粒体裂变重要，这种相互作用已经难以在体外概括。我们的目标是更好地模拟蜂窝环境，其中DRP1以及MFF相互作用。为此目的，含有NTA（镍2+）头部基团的非限制性浓度的脂质体通过如上所述再水化脂质膜制备。脂质溶液最初由异质直径单层和多层囊泡的由溶液（ 图1a）的不透明度为证。此不透明度通过冻融（ 图1b），这减少了多层囊泡的患病率降低。脂质体直径进一步通过挤压通过聚碳酸酯过滤器，这导致澄清溶液（ 图1c）匀浆。
2，观察膜的小管。这些调查结果的基础上，我们利用PC，PE，Ni和CL（被称为富脚手架脂质体或ESL）组成，以促进聚合DRP1-MFF的有序组装能够诱导膜变形复杂的新模板。具体地，增加的NTA（镍离子 ）和（分别为10摩尔％和15摩尔％），利用心磷脂脂质这种应用。然后，GFP或MFF被拴在DRP1（ 图2）的存在和不存在的ESL模板，以及DRP1的重塑膜的能力定性评估。在没有DRP1的，既不MFF也不GFP导致膜的变形（ 图3a，b）中 ，同样在GFP-装饰的ESL的情况下，只观察到无特征的脂质体（ 图3c）。然而，当DRP1加到MFF装饰ESL模板，脂质体的重塑是明显的（ 图3d）。
虽然大分子复合物的形成清楚地表明DRP1和MFF之间的相互作用，这种定性分析是单独确定无法这样一个互动的功能作用。因此，我们利用的孔雀石绿磷酸盐生成测定18来评估响应于与MFF相互作用DRP1的催化活性的改变。如所描述的先前2，我们最初利用一个简单的支架脂质体（SL; 3.3摩尔％的DGS-NTA（镍2+），96.7摩尔％DOPC）调查独上DRP1结构和功能MFF的效果。与DRP1的非特异性相互作用NTA（镍2+）先前已被描述20，所以SL最初设计为含有低浓度的NTA（镍2+）的，以避免博士的非特异性活性刺激P1。在ESL的较大量的NTA（镍离子 ），利用His-标记的GFP作为对照被发现是屏蔽的Ni 2+和防止非特异性DRP1相互作用至关重要。通过MFF或绿色荧光蛋白（如在图2中所示）SL脂质体的装饰后，自组装的程度可以通过测量DRP1的GTP酶活性进行评估。在不存在脂质体，DRP1具有相对低的基础GTP酶的活性，它是略通过加入SL的增强。与MFF这些支架脂质体的装饰提高GTP酶的活性（ 图4a中 ，1.8倍）。相反，当暴露NTA（镍2+）头部基团封闭带His标签的绿色荧光蛋白，这增强GTP酶活性被烧蚀。我们还测试FIS1，已建议有在线粒体裂变21,22一个角色的OMM蛋白的作用，尽管这在最近的研究7,23受到了挑战。 FIS1的圈养缺乏其跨膜区到SL也未能引起DRP1的GTP酶的活性（ 图4a）的刺激。
然后，我们使用含有心磷脂的少量（SL / CL：SL与10摩尔％心磷脂替换DOPC）稍微更复杂的脂质支架，以确定此线粒体脂质在DRP1以及MFF的相互作用的作用。心磷脂的这种温和的浓度特别选择由心磷脂限制DRP1的刺激如前面所述10。类似SL，SL除/ CL到DRP1的导致GTP酶的活性有轻微刺激，是由他的圈养标记FIS1或GFP以脂质体逆转。观察MFF和心之间的协同作用为DRP1的GTP酶的活性，刺激了2.6倍，当它与MFF-SL装饰/ CL（ 图4b）培养。
膜流动性和能力Ò˚FDRP1重塑脂质双层已经提出以提高其GTP酶活性。因此，我们试图研究的膜流动性/挠性使用柔性支架脂质体的效果。这是通过在SL与DOPE取代35摩尔％DOPC的/ CL来实现（SL / PE / CL），先前已显示，以允许DRP1介导的膜重塑10。未装饰SL / PE / CL支架脂质体DRP1的增加略有提高DRP1 GTP酶的活性，而这些脂质体与GFP的装饰消除这种影响。当SL / PE / CL模板，装饰着MFF，DRP1活性增强（ 图4c，2.4倍）。如我们先前已经显示，DRP1的重塑脂质体到脂质小管的能力通过加入PE的向支架的脂质体增强。有趣的是，这种改进的制管通向一个螺旋DRP1聚合物的形成没有造成任何刺激较大时相比，脂质体是DRP1无法改造 使用这些适应性脂质模板，MFF和DRP1被发现在体外更原生环境互动。这项技术使我们能够控制DRP1，MFF（通过NTA（镍离子 ）浓度），并且出现了规范这种大分子复合物的组合具体脂类（心磷脂和PE专）的相对丰度。由于我们已经证明，这种方法可以用于通过电子显微镜来可视化MFF-招募DRP1的膜重建，并用GTP酶活检测，以确定它的催化活性DRP1组件的影响。 71fig4.jpg“/> 
图1： 类脂制剂示意图。 （ 一 ）在悬浮，不同大小的脂质体形成并包括单层和multilamel拉尔囊泡，这导致不透明的溶液（插图）。 （ 二 ）冻融溶液结果在脂质体中，它仍然在直径异质的更单层人口。冻融澄清溶液（插图）。 （c）该脂质溶液的挤出均匀化的脂质体直径（1.0微米在本例中），并在澄清溶液（插图）的结果。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图2： 方法来评估蛋白质组装 。脚手架上的脂质体的示意图描绘伴侣蛋白装配提出。他的标记伙伴蛋白或GFP物与支架脂质体，然后DRP1孵育与装饰或未修饰脂萨姆。这些DRP1-预装配的脂质体然后可以通过结构的方法（电子显微镜）和功能分析（GTP酶测定）进行分析。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图3：DRP1 招聘的结构评估。 GFP或MFF的负染色透射显微照片（分别为C，D，）（分别为A，B，）饰脂质体单独或与DRP1培养。比例尺= 100纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 脚手架脂质体酶法测定 。 （A - C）的磷酸酯随时间的产生进行测定（插图），并测定第k 猫 。这种方法适用于SL-拴系蛋白（A），SL / CL-拴系蛋白（B），或SL / PE / CL-拴系蛋白（C）。 ＃：P <0.05，*：P <0.0001，**：P <0.000001由不成对学生t检验确定。所有误差棒代表从3独立样本标准差。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这个协议提供了调查涉及整合膜蛋白的蛋白质 - 蛋白质相互作用的方法。利用模块化脂质体脚手架，调查能够评估脂质近侧环境的一种或多种蛋白质的活性。以前的研究已经证明了质膜24的受体酶类似的方法- 26。我们扩大了这种方法纳入脂质辅因子和探索弥补线粒体分裂机械mechanoenzymatic核心蛋白之间的相互作用。
对于以上提出的模型系统中，我们发现，MFF装饰SL增强DRP1自组装。此外，我们现在表明，MFF装饰ESL模板被有效地由野生型DRP1改造，以形成延长的管状结构。我们还评估了各种线粒体脂质的作用，包括带负电荷的心磷脂和锥形脂质的PE。心磷脂与MFF协同作用，进一步提高DRP1自组装，而膜的灵活性和流动性由PE赋予增强膜制管，但不会进一步增加MFF诱发的刺激。
为了评估膜形态超微结构变化，EM分析被要求。 DRP1 GTP酶的活性是通过聚类和未重塑脂质任何大的程度2丝状聚合物的组件升高。然而，使用了更多的线粒体状SL / PE / CL模板时，观察膜变形。有趣的是，酶活性没有提高。因此，在EM研究是在识别，否则使用功能测定法被错过关键区别是至关重要的。
虽然这种技术是强有力的探索功能和可溶性蛋白质和可溶性蛋白质结构域的相互作用，这些脂质支架不能解释跨膜结构域的作用秒。这是一个重要的考虑，因为跨膜结构域可以影响动态蛋白质过程，如自组装27和侧向扩散28 -脂质双层30。如果这些因素都对在膜表面评估蛋白质相互作用至关重要的，用洗涤剂然后传统脂质重建实验会受到青睐。替代系绳也可以探索以控制膜锚定蛋白的招聘和流动性。
除了使用His标记的蛋白质用NTA（镍2+）脂质锚，可以利用其他的系绳如生物素-共轭31或反应性基团共轭的脂质。这些共价修饰会更稳定地陷阱蛋白在脂质表面，但流动性和这些因素交换可能会被削弱。这样，该系绳应仔细在蛋白质复合物的上下文中考虑正在研究中。当求索响使用这种方法，圈养蛋白脂质模板的模式具有影响某些分析的潜力。例如，His-标签束缚到NTA（镍2+）方法可能更适合于原地测定，而不是分离的实验中，特别是在瞬变蛋白质-蛋白质相互作用的情况下。这显然是在图3中通过原位负染色电子显微镜和沉淀法之间的差异证明。
在未来，两种或更多种这些锚脂质与不同目标首基的组合可以实现为允许多个蛋白质支架模板的招募而无需单个脂质系绳竞争。此外，各成分的相对丰度可通过改变脂质组合物进行管理。附加脂质辅因子，如磷酸肌醇，心磷脂和磷脂酰丝氨酸，可以很容易地被引入在这些模板来评估的各种因素的分离的冲击。
总的来说，这些脂质支架代表了调查近脂膜复杂的蛋白质相互作用一个新的平台。这些模板是容易产生，并且简单定制的范围的各种应用，包括酶测定，电子显微镜，或荧光成像。此外，脂质组合物可以配制成类似于感兴趣的细胞器或膜微区在这些特定区域，以便更好地概括蛋白质功能。使用这些技术，生物化学可以探测膜结合和膜相关的蛋白质的复杂的相互作用与他们的合作伙伴和他们的环境。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
