قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب
Summary
يمكن الميتوكوندريا الاستفادة من إمكانات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (Δ Ψm) لعزل الكالسيوم (الكالسيوم 2+)، مما يتيح لهم تشكيل الكالسيوم عصاري خلوي 2+ يشير داخل الخلية. نحن تصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص وΔΨ م في الخلايا الحية باستخدام الأصباغ الفلورية والفحص المجهري متحد البؤر.
Abstract
وبصرف النظر عن دورها الأساسي في توليد اعبي التنس المحترفين، تعمل الميتوكوندريا أيضا الكالسيوم المحلي (كا 2+) مخازن لتنظيم بإحكام داخل الخلايا تركيز الكالسيوم 2+. للقيام بذلك، الميتوكوندريا الاستفادة من الإمكانيات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (ΔΨ م) إلى عزل الكالسيوم 2+. تدفق الكالسيوم 2+ في الميتوكوندريا يحفز ثلاثة أنزيم نازع للهيدروجين معدل الحد من دورة حمض الستريك، وزيادة نقل الإلكترون من خلال الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) المجمعات. يحافظ هذا التحفيز ΔΨ م، التي تبدد مؤقتا على أيونات الكالسيوم إيجابية تعبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في مصفوفة الميتوكوندريا.
نحن هنا وصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص وΔΨ م في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري. بواسطة permeabilizing الخلايا، والكالسيوم الميتوكوندريا 2+ يمكنيتم قياسها باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ مؤشر فلوو-4، صباحا، مع قياس ΔΨ م باستخدام tetramethylrhodamine صبغة الفلورسنت، استر الميثيل، فوق كلورات (TMRM). الاستفادة من هذا النظام هو أن هناك القليل جدا من التداخل الطيفي بين الأصباغ الفلورية، مما يتيح القياس الدقيق للالميتوكوندريا الكالسيوم 2+ وΔΨ م في وقت واحد. عن طريق إضافة متتابعة من الكالسيوم 2+ قسامات، كاليفورنيا الميتوكوندريا 2+ امتصاص يمكن رصدها، والتركيز الذي كا 2+ يدفع الميتوكوندريا الانتقال نفاذية الأغشية وفقدان ΔΨ م تحديدها.
Introduction
الميتوكوندريا تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا تركيز الكالسيوم 2+ من خلال العمل كحلقة المحلية الكالسيوم 2+ مخازن 1. كاليفورنيا 2+ يدخل الميتوكوندريا عبر uniporter كاليفورنيا 2+، وهي عملية يقودها التدرج الكهروكيميائية موجود عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا (ΔΨ م) 2. مرة واحدة داخل المصفوفة الميتوكوندريا، كاليفورنيا 2+ يمكن تنشيط الفسفرة التأكسدية من خلال تحفيز ثلاثة أنزيم نازع للهيدروجين معدل الحد من دورة حمض الستريك 3. يحافظ هذا التحفيز ΔΨ م، التي تبدد مؤقتا على أيونات الكالسيوم إيجابية تعبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا في مصفوفة الميتوكوندريا. إذا كا 2+ تركيز داخل الميتوكوندريا يصبح عالية جدا، ويمكن البدء في الانتقال نفاذية الميتوكوندريا، مما أدى إلى تبديد ΔΨ م، وcessatioن من الفسفرة التأكسدية وتحريض موت الخلايا مسارات الإشارات 4.
الدور الهام الذي تلعبه الميتوكوندريا في التخزين المؤقت المكاني من الكالسيوم الخلوي يجعل رصد دقيق من الكالسيوم الميتوكوندريا حرجة. وقد وضعت أساليب مختلفة لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا، بما في ذلك استخدام الأصباغ القائمة على رودامين. واحدة من هذه الصبغة، Rhod-2، صباحا، هو فعال جدا في التقسيم إلى الميتوكوندريا لقياس الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ مستويات 5 و 6. ومع ذلك، يجب توخي الحذر لأن بعض صبغ سوف تتراكم في عضيات أخرى مثل الجسيمات الشحمية، أو البقاء في العصارة الخلوية الخلية. ومع ذلك، تحليلات المصب ويمكن استخدام لتمييز هذه الإشارات من تلك الموجودة في الميتوكوندريا 7.
أسلوب آخر لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا تستخدم مراسل فلوري يبني 8 </s تصل>. ويستفيد من هذه المجسات المشفرة وراثيا هي أنها يمكن أن تستهدف على وجه التحديد إلى الميتوكوندريا باستخدام الببتيدات-N محطة الذاتية، على سبيل المثال إشارة استهداف N-الطرفية من البشر كوكس فرعية الثامن. واستخدمت هذا النظام لإنشاء مسبار aequorin استهداف الميتوكوندريا التي أثبتت مفيدة للغاية لتحقيق الكالسيوم الميتوكوندريا مما يشير إلى 9. العيب الرئيسي لهذه التحقيقات المشفرة وراثيا هو أنها تحتاج إلى إدخالها في الخلايا عن طريق التعبير عابر (وهو ليس ممكنا بالنسبة لأنواع الخلايا معينة، ويمكن أن تؤدي إلى نتائج متغيرة) أو عن طريق إنشاء نظم التعبير مستقرة (والذي هو مضيعة للوقت).
الالتفاف على المشاكل المذكورة أعلاه، قمنا بتطوير بروتوكول جديد لقياس الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ وΔΨ م في وقت واحد. ويستند هذا البروتوكول على الطريقة الموصوفة سابقا أن يضيف الكالسيوم دخيلة على الخلايا permeabilizedالصورة = "XREF"> 10. بروتوكول لدينا ثلاثة المزايا الرئيسية مقارنة مع الطرق الأخرى: أولا، ونحن نستخدم فلوو-4، صباحا وTMRM لمراقبة الكالسيوم الميتوكوندريا 2+ وΔΨ م، وهما الأصباغ التي لها خصائص طيفية مميزة جدا. ثانيا، وpermeabilized الخلايا بحيث إشارة فلوو-4 ويكتشف فقط الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ وليس كا 2+ المترجمة إلى العضيات الأخرى أو العصارة الخلوية الخلية؛ وثالثا، استخدام فلوو-4 لكشف الكالسيوم الميتوكوندريا 2+ يسمح سريعة وبسيطة تلطيخ الخلية، ويلغي أي قضايا ترنسفكأيشن الخلية أو التحول التي توجد في حالة استخدام تحقيقات المشفرة وراثيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكالسيوم يلعب دورا حاسما في العديد من عمليات الخلية، بما في ذلك تقلص العضلات، مما يشير الى العصبية والخلايا انتشار 13. غالبا ما ترتبط الزيادة في تركيز الكالسيوم الخلية مع الطلب على الطاقة، مع الكالسيوم قادرة على تحفيز مباشرة الميتوكوندريا الفسفرة التأ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور كريستين Elgass والدكتورة سارة العقيدة من جامعة موناش مايكرو التصوير للحصول على المساعدة التقنية، ويلكوم ترست ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة للحصول على الدعم المالي. ويدعم MMcK مجلس البحوث مخطط استراليا المستقبل زمالة (FT120100459)، ومؤسسة وليام باكلاند، مؤسسة أمراض الميتوكوندريا الأسترالية (AMDF)، ومعهد هدسون للأبحاث الطبية وجامعة موناش. وأيد هذا العمل من قبل برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية حكومة فيكتوريا.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
| 0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. . 2. n. d. Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
