线粒体钙和线粒体膜的同时测量通过荧光显微镜活细胞的潜在
Summary
线粒体可以利用在其内的膜（Δ 膜电势 ）的电化学势螯合钙（Ca 2+），允许它们塑造细胞内的Ca 2+的细胞内信号传导。我们描述了使用荧光染料和共聚焦显微镜同时测量线粒体的Ca 2+摄取和ΔΨ 微米活细胞的方法。
Abstract
除了在产生的ATP其重要作用，线粒体还充当本地钙（Ca 2+）缓冲器，以紧密地调节细胞内Ca 2+浓度。要做到这一点，线粒体利用电化学势在其内膜（ΔΨ 米 ）隔离的 Ca 2+。 的 Ca 2+的流入线粒体刺激三羧酸循环三个限速脱氢酶，通过氧化磷酸化（OXPHOS）配合增加的电子转移。这种刺激保持ΔΨ 男 ，作为正钙离子越过线粒体内膜进入线粒体基质被暂时消散。
我们在这里描述了使用共聚焦显微镜同时测量线粒体的Ca 2+摄取和ΔΨ 微米活细胞的方法。由透化细胞，线粒体的 Ca 2+能使用荧光钙指示剂的Fluo-4，AM被测定，与使用荧光染料四甲（TMRM）ΔΨ 男 ，甲酯，高氯酸盐测量。本系统的好处是，有荧光染料之间很少光谱重叠，使线粒体的Ca精确测量2+和ΔΨ 米同时。使用顺序除钙等分，线粒体钙的摄取可以被监控，并在其中钙诱导线粒体膜通透性过渡和ΔΨ的损失浓度中号决定。
Introduction
线粒体通过充当本地的 Ca 2+缓冲液1在调节细胞内Ca 2+浓度的一个重要的角色。钙离子通过钙单向转运体进入线粒体，通过跨线粒体内膜（ΔΨ 米 ）2存在电化学梯度驱动的方法。一旦线粒体基质内，钙离子可通过刺激三羧酸循环3三限速脱氢酶激活氧化磷酸化。这种刺激保持ΔΨ 男 ，作为正钙离子越过线粒体内膜进入线粒体基质被暂时消散。如果线粒体内的Ca 2+浓度变得非常高，线粒体通透性转换可以启动，导致ΔΨ 米耗散，cessatio氧化磷酸化的n和细胞死亡的信号传导途径4的诱导。
线粒体在细胞中钙的缓冲空间发挥的重要作用，使线粒体钙的准确的监测非常重要。各种方法已被建立并监控线粒体钙，包括使用基于若丹明染料。一个这样的染料，RHOD-2，AM是在分区到线粒体相当有效测量线粒体的 Ca 2+水平5,6。然而，必须注意用作某些染料将在其他细胞器，如脂质体的积累，或保留在细胞胞质溶胶。然而，下游分析可被用来从那些从线粒体7区分这些信号。
监测线粒体钙另一种技术利用荧光记者构造8 </s了>。这些基因编码的探针的好处是，它们可以通过使用内源性N-末端肽，例如人COX VIII亚基的N-末端的定位信号进行具体靶向线粒体。该系统已被用来产生已经证明了线粒体调查钙信号9是非常有用的线粒体靶向探针水母发光蛋白。这些基因编码的探针的主要缺点是，它们需要被引入到由瞬时表达的细胞（其是不适合某些细胞类型可行，并且能够产生不同的结果），或者通过创建稳定表达系统（这是耗时）。
为了规避上述问题，我们已经开发出一种新的协议，同时测量线粒体钙和ΔΨ 米此协议是基于添加了外源钙到透化的细胞一前述方法S =“外部参照”> 10。我们的协议比其他方法三大优势：首先，我们使用荧光- 4，AM和TMRM监测线粒体钙和ΔΨm，即具有非常独特的光谱特性两种染料;其次，将细胞透化，以使的Fluo-4信号仅检测线粒体的Ca 2+和不钙定位于其它细胞器或细胞胞质溶胶;第三，使用的Fluo-4的检测线粒体的 Ca 2+允许快速和简单的细胞染色，否定存在如果使用遗传编码的探针的任何细胞转染或转化的问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
钙起着在许多细胞过程，包括肌肉收缩，神经元信号传导和细胞增殖13的关键作用。在细胞钙离子浓度的增加往往与能源需求有关，与钙能直接刺激线粒体氧化磷酸化，以提高ATP生成3。因此，重要的是，我们必须有效地监测线粒体钙累积，并且能够以比较如何这个功能是由遗传因素和药剂的影响的能力。
该协议中的关键步骤
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢希尔丝廷Elgass博士和莫纳什显微成像技术援助萨拉信条博士和威康信托基金会和医学研究理事会英国的财政支持。 MMcK支持澳大利亚研究理事会未来的奖学金计划（FT120100459），威廉·巴克兰基金会，澳大利亚线粒体病基金会（AMDF），医学研究和莫纳什大学的哈德逊研究所。这项工作是由维多利亚州政府经营性基础设施支持计划的支持。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
| 0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
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