Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü
Summary
Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.
Abstract
Apart ATP üreten önemli rolleri dışında, mitokondri de (Ca 2+) sıkıca hücre içi Ca 2 + konsantrasyonu düzenleyen tamponlar, yerel kalsiyum gibi hareket ederler. Bunu yapmak için, mitokondri Ca 2+ ayırmak için kendi iç zarı (ΔΨ m) arasında elektrokimyasal potansiyelini kullanmak. Mitokondriye Ca 2 + akını oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kompleksleri ile elektron transferini artırmak, sitrik asit döngüsünün üç oran sınırlayıcı dehidrojenazları uyarır. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur.
Biz konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler aynı anda ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m burada bir yöntem açıklanmaktadır. Hücreleri permeabilizing, mitokondriyal Ca 2+ canfloresan boya tetrametilrodamin kullanılarak ΔΨ m, metil ester, perklorat (TMRM) ölçümü ile, floresan Ca2 + göstergesi Fluo-4 AM kullanılarak ölçülebilmektedir. Bu sistemin avantajı, floresan boyalar arasında çok az spektral örtüşme aynı zamanda, doğru mitokondriyal Ca + 2 ve ölçüm ΔΨ m sağlayan olmasıdır. Ca2 + alikotları dizisel ilavesini kullanarak, mitokondriyal Ca 2 + alımı izlenebilir ve Ca2 + mitokondriyal membran geçirgenliği geçiş ve ΔΨ kaybını indükleyen edildiği konsantrasyon saptanmıştır m.
Introduction
Mitokondri yerel Ca 2 + tampon 1 olarak hareket ederek hücre içi Ca2 + konsantrasyonu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ca 2 +, Ca 2 + uniporter yoluyla mitokondri iç zarının (ΔΨ m) 2 arasında var olan elektrokimyasal gradyan tarafından yönlendirilen bir süreç mitokondri girer. Bir kez mitokondrial matriks içinde, Ca 2 + sitrik asit döngüsü 3 üç hız sınırlayıcı dehidrojenazları uyararak oksidatif fosforilasyonu aktif hale getirebilirsiniz. Bu uyarım pozitif kalsiyum iyonları mitokondrial matriks içine mitokondri iç zarı çapraz olarak geçici dağılır ΔΨ m, korur. Mitokondri içinde Ca2 + konsantrasyonu çok yüksek olursa, mitokondriyal geçirgenlik ΔΨ m dağılımı ile sonuçlanan başlatılabilir, cessatioOksidatif fosforilasyon, n ve yolları 4 sinyal hücre ölümünün indüklenmesi.
mitokondri hücresel kalsiyum mekansal tamponlama oynadıkları önemli rol mitokondriyal kalsiyum doğru izlenmesi kritik hale getirir. Çeşitli yöntemler Rodamin bazlı boyaların kullanımı dahil mitokondriyal kalsiyum, izlemek için kurulmuştur. Böyle bir boya, Rhod-2, AM, 6 mitokondriyal Ca 2 + düzeyleri 5 ölçmek için mitokondri bölümleme oldukça etkilidir. Bazı boya lipozomlar gibi diğer organellere birikir, ya da hücre sitozol kalır Ancak dikkat etmek gerekir. Bununla birlikte, alt analizler mitokondri 7'den olanlardan bu sinyalleri ayırt edilmesi için kullanılabilir.
Mitokondriyal kalsiyum izlemek için başka bir teknik floresan muhabiri 8 oluşturur kullanır </s > Yukarı. Bu genetik olarak kodlanmış prob yararı özellikle, örneğin, insan COX alt birim VIII N-terminal hedefleme sinyali endojen N-terminali peptidi kullanılarak mitokondri hedef olabilir. Bu sistem 9 sinyalizasyon mitokondriyal kalsiyum araştırmak için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır mitokondriyal hedefli aequorin probu oluşturmak için istihdam edilmiştir. Bu genetik olarak kodlanmış prob ana dezavantajı, geçici ekspresyonu ile hücre içine gereken (belirli hücre tipleri için uygun değildir ve değişken sonuçları üretebilir) veya sabit bir sentezleme sistemleri (ki zaman alıcı) oluşturarak olmasıdır.
Yukarıda özetlenen sorunları aşmak için, biz aynı anda mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m ölçmek için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, permeabilize hücrelerin ekzojen kalsiyum ekler daha önce tarif edilen yönteme dayalıdırs = "xref"> 10. Bizim protokol diğer yöntemlere göre üç ana avantajı vardır: Birincisi, biz Flu-4, AM ve TMRM mitokondriyal Ca 2+ ve ΔΨ m, çok farklı spektral özelliklere sahip iki boyalar izlemek için kullanın; ikincisi, hücreler Flu-4 sinyali sadece mitokondriyal Ca tespit edilir +2 ve Ca +2 diğer organellere veya hücre sitoplazmada lokalize olmayan şekilde permeabilize; ve üçüncüsü, Flu-4 kullanımı 2+ mitokondriyal Ca tespit etmek için genetik olarak kodlanmış problar kullanılarak eğer mevcut herhangi bir hücre transfeksiyon veya transformasyon sorunları inkâr, hızlı ve basit hücre boyama sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalsiyum kas kasılması, nöronal sinyalleşme ve hücre çoğalması 13 de dahil olmak üzere bir çok hücre süreçlerinde, çok önemli bir rol oynar. Hücre kalsiyum konsantrasyonlarında artışlar genellikle doğrudan ATP nesil 3 yükseltmek için mitokondrial oksidatif fosforilasyonu teşvik edebilmek kalsiyum ile enerji talebi ile ilişkilidir. Etkili bir mitokondriyal kalsiyum birikimini izlemek ve bu fonksiyon genetik faktörler ve farmakolojik ajanların hem n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansal destek için Dr. Kirstin Elgass ve teknik yardım için Monash Micro Görüntüleme Dr Sarah Creed ve Wellcome Trust ve Tıbbi Araştırma Konseyi UK teşekkür ederim. MMcK Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu Programı (FT120100459), William Buckland Vakfı, Avustralya Mitokondriyal Hastalık Vakfı (AMDF), Tıbbi Araştırma ve Monash Üniversitesi Hudson Enstitüsü desteklenmektedir. Bu eser Victoria Hükümeti Operasyonel Altyapısının Desteklenmesi Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
| 0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. . 2. n. d. Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
