מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Summary

המיטוכונדריה יכול לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (Δ _Ψm) כדי לעקל סידן (Ca ^{2 +),} המאפשר להם לעצב Ca cytosolic ²⁺ איתות בתוך התא. אנו מתארים שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ בתאים חיים באמצעות צבעי ניאון ו מיקרוסקופיה confocal.

Abstract

מלבד התפקיד החיוני שלהם ביצירת ATP, המיטוכונדריה גם לשמש סידן מקומי (Ca ^{2 +)} מאגרים להסדיר בחוזקה ריכוז תאיים Ca ^{2 +.} לשם כך, המיטוכונדריה לנצל את הפוטנציאל אלקטרוכימי על פני הקרום הפנימי שלהם (ΔΨ _{מ ')} כדי לעקל Ca ^2+. זרם של Ca ^{2 +} לתוך המיטוכונדריה מגרה שלושה דהידרוגנאז שער הגבלת של מעגל החומצה הציטרית, הגדלת העברת אלקטרונים דרך זרחון חמצוני (OXPHOS) תסביכים. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ _{מ ',} אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה.

אנו מתארים כאן שיטה המיטוכונדריה מדידה בו זמנית ספיגת Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ confocal. על ידי permeabilizing התאים, Ca המיטוכונדריה ²⁺ יכוללהימדד באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטור Fluo-4, בבוקר, עם מדידת ΔΨ _מ באמצעות אסתר tetramethylrhodamine, מתיל צבע פלואורסצנטי ניאון, פרכלורט (TMRM). היתרון של מערכת זו הוא כי יש חפיפה ספקטרלית מעט מאוד בין צבעי ניאון, המאפשר מדידה מדויקת של המיטוכונדריה Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ זמנית. באמצעות תוספת הרציפים של aliquots Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +} המיטוכונדריה ספיגה ניתן לנטר, ואת הריכוז שבו Ca ^{2 +} גורם מעבר חדירות קרום המיטוכונדריה ואובדן ΔΨ _אני נחוש.

Introduction

המיטוכונדריה לשחק תפקיד חשוב בוויסות ריכוז תאיים Ca ^{2 +} על ידי מתנהג כמו מאגרים מקומיים Ca ^{2 + 1.} Ca ^{2 +} מזין את המיטוכונדריה דרך uniporter Ca ^2+, תהליך מונע על ידי שיפוע אלקטרוכימיים שקיים על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה _(מ ΔΨ) ^2. פעם בתוך מטריקס המיטוכונדריה, Ca ^{2 +} יכול להפעיל זרחון חמצוני ידי גירוי שלושה דהידרוגנאז ומגביל הקצב של מחזור חומצת לימון ^3. גירוי זה מפעיל כיום ΔΨ _{מ ',} אשר מתפזר באופן זמני כמו יוני סידן החיובי לחצות את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לתוך המטריצה המיטוכונדריה. אם ריכוז Ca ^{2 +} בתוך המיטוכונדריה הופך להיות מאוד גבוה, מעבר חדירות המיטוכונדריה יכול להיות יזם, וכתוצאה מכך את הפיזור _מ ΔΨ, את cessation של זרחון חמצוני האינדוקציה של מוות של תאי מסלולי איתות ^4.

התפקיד החשוב כי המיטוכונדריה לשחק חציצה המרחבי של סידן הסלולר הופך את הניטור המדויק של סידן המיטוכונדריה קריטי. שיטות שונות הוקמו לפקח סידן המיטוכונדריה, כולל את השימוש של צבעים המבוססים rhodamine. צבע אחד כזה, רוד-2, AM, הוא די יעיל מחיצות למיטוכונדריה כדי למדוד את רמות Ca ²⁺ המיטוכונדריה ^{5, 6.} עם זאת, הטיפול חייב לשמש קצת צבע יצטברו אברונים אחרים, כגון ליפוזומים, או להישאר cytosol התא. אף על פי כן, ניתוחים במורד הזרם יכול להיות מועסק על מנת להבחין אותות אלה מאלה מהמיטוכונדריה ^7.

טכניקה נוספת לפקח סידן המיטוכונדריה מנצלת כתב ניאון בונה ⁸ </s עד>. היתרון של בדיקות המקודדות גנטי אלה הוא שהם יכולים להיות ממוקדים במיוחד אל המיטוכונדריה באמצעות פפטידים אנדוגני N-terminal, למשל אות מיקוד N-terminal של VIII למקטע אדם COX. מערכת זו כבר מועסקת על מנת ליצור בדיקת aequorin במיקוד המיטוכונדריה אשר הוכיחה מאוד שימושי לחקירת סידן המיטוכונדריה איתות ^9. החסרון העיקרי של בדיקות מקודדות גנטי אלה הוא שהם צריכים להיות מוחדרים לתאים על ידי ביטוי חולף (וזה לא ריאלי עבור סוגי תאים מסוימים יכולים לייצר תוצאות משתנות) או באמצעות יצירת מנגנוני ביטוי יציבים (אשר זמן רב).

כדי לעקוף את הבעיות שתוארו לעיל, פיתחנו פרוטוקול חדש למדידת המיטוכונדריה Ca ^{2 +} ו ΔΨ _מ זמנית. פרוטוקול זה מבוסס על שיטה שתוארה לעיל המוסיפה סידן אקסוגניים לתאי permeabilizeds = "Xref"> 10. יש הפרוטוקול שלנו יש שלושה יתרונות עיקריים על פני שיטות אחרות: ראשית, אנו משתמשים Fluo-4, בבוקר TMRM לפקח Ca המיטוכונדריה ^{2 +} ו _מ ΔΨ, שני צבעים שיש תכונות ספקטרליות ברורות מאוד; ושנית, התאים permeabilized כך שהאות Fluo-4 רק מזהה המיטוכונדריה Ca ²⁺ ולא Ca ²⁺ מקומי אברונים אחרים או cytosol התא; ושלישי, השימוש Fluo-4 לזהות Ca המיטוכונדריה ²⁺ מאפשר מכתים תא מהיר ופשוט, שלילת בעיות transfection או טרנספורמציה תא קיימות אם באמצעות בדיקות מקודדות גנטי.

Protocol

1. הכנת תאים לגדל תאים על תרבות מנות תא 10 ס"מ או 75 ס"מ 2 צלוחיות בתקשורת תרבות [10 מ"ל בינוני הנשרים Modified של Dulbecco (DMEM) בתוספת 5% (v / v) בסרום שור עוברית (FBS) ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S )], בעמ '37 ° C / 5% CO 2. …

Representative Results

השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבחון את ההשפעות של מוטציה MT-ND5 על היכולת של המיטוכונדריה בתא 143B למאגר עליות סידן 12. בדוגמה המוצגת כאן, תאים 143B שליטה הועמסו עם TMRM ו Fluo-4, AM לפני permeabilization עם digitonin. אחרי 5 דקות של הדמיה, שמונה תוספות רציפות של די?…

Discussion

סידן משחק תפקיד קריטי בתהליכים סלולריים רבים, כוללים התכווצות שרירים, איתות עצבה תא התפשטות ^13. עליות שריכוז יוני הסידן התא הקשורים לעתים קרובות עם הביקוש לאנרגיה, עם סידן מסוגל לעורר זרחון חמצוני המיטוכונדריה ישירות לגדל דור ה- ATP ^3. לכן זה חי…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641