Summary
En enkel rød blodcellelysering fremgangsmåte for å etablere B-LCLer ble utviklet med høy immortalisering effektivitet, noe som krever en liten mengde av blod og sparer tid fra start til kryopreservering.
Protocol
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen ved Institutt for genetikk og utviklingsbiologi, og protokollen følger institusjonelle retningslinjer for menneskelig velferd.
1. Utarbeidelse av EB virus
- På dag 1, tine B95-8-celler og kultur i 6 ml komplett RPMI 1640 medium, supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, og antibiotika (100 ug / ml streptomycin, 100 U / mL penicillin) i en T25 kultur kolbe. Plasserer kulturen kolbe i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- På dag 2, observere cellemorfologi under et mikroskop. Cellene er i god stand når de er lyse og runde. Tilsett 10 ml komplett RPMI 1640-medium.
- På dag fire, tilsett 10 ml fersk komplett RPMI 1640 medium, og deretter overføre til en T75 kultur kolbe.
- På dag 8, tilsett 20 ml komplett RPMI 1640 medium.
- Opprettholde cellene for 8 dager uten å legge fersk medium, dvs. sult.
- På dag 16, observere cellerobservert under mikroskopet. Samle cellene i et 15 ml sentrifugerør, 12 ml / rør.
- Cryo-bevare ved -80 ° C i 1 time, og deretter hurtig tines ved 37 ° C. Gjenta 3 ganger inntil viruspartiklene blir frigitt fra cellene.
- Sentrifuger ved 240 xg i 10 min ved romtemperatur.
- Filter supernatanten gjennom et 0,22 mikrometer filter, delmengde, 12 ml / rør, og oppbevar ved -80 ° C.
2. Behandling av Whole Blood Red Blood Cell Lysis Buffer
- Tilsett 0,5 ml fullblod antikoagulert med EDTA · K 2 til en 15 ml tube.
- Sette 1 ml røde blodceller lyseringsbuffer (filtrert ved 0,22 um filter og opptint til romtemperatur før bruk) i fullblod og bland godt. Plasser blandingen ved romtemperatur i 4 min. Deretter legger 5-7 ml 1x PBS raskt til stopp reaksjon.
- Sentrifuger ved 240 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Hvite blodlegemer vil utfelles på bunnen av røret.
- Kast supernatanten, og vaske nedbør ved å legge 7 ml 1640 grunnleggende medium. Sentrifuger i 5 min ved 240 x g ved romtemperatur. Gjenta to ganger.
- Resuspender cellepelleten i 300 ul transformasjonsmedium (RPMI 1640 medium inneholdende 20% føtalt bovint serum og 10 ug / ml fytohemagglutinin (PHA)).
3. EBV infeksjon
- Legg 60 ul av 20 ug / ml cyklosporin A (CsA) til cellesuspensjonen.
- Hurtig tine en delmengde av EBV ved 37 ° C. Legg 240 mL EBV til cellesuspensjonen.
- Bland godt og plassere cellesuspensjonen til en 96-brønns plate, 200 ul per brønn. For å unngå fordampning, tilsett 200 pl 1 x PBS til hver brønn omkring i 96-brønns plate. Sett platen i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
4. Utvidelse og kryokonservering B-LCLer
- Endre halvparten av mediet en gang per uke for den første måneden etter EBV infeksjon. Bare en tykk Layer av cellefragmenter er synlig under mikroskop ved dag 7 (figur 2). Etter en måned med EBV-infeksjon, lymfoblastoide celleklynger som er synlige under et tykt lag av cellefragmenter under mikroskop (figur 2).
- Endre halvparten av mediet etter 3 dager før cellegruppene er klart synlige under mikroskopet (figur 2). Typisk, tar denne fremgangsmåte 10 til 20 dager.
- Etter blanding pipettér cellene og overføre til den 24-brønns plate. Doble volumet av kultur medium med komplett RPMI 1640, mens den blir gul. Denne prosessen er avhengig av hastigheten av celleveksten.
- Deretter overføres cellene til T25 kulturflaske. Doble volumet av kultur medium som det blir gul inntil volumet av medium utvides til 10 - 15 ml.
- Endre mellom 24 timer før frysing. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 240 x g. Cellene telles med en celleteller og fryse ved en tetthet på 5 - 10 x 10 6 / ml i frOzen stamløsning inneholdende 90% FBS og 10% dimetylsulfoksyd (DMSO). Fryse ved en hastighet på 1 ° C pr minutt til -80 ° C og deretter overføre direkte inn i flytende nitrogen.
5. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse 17
- Fremstille et B-LCLer enkelt cellesuspensjon med det 1640-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum. Seed 3 x 10 4 celler per brønn på 96-brønners plate, 100 ul pr brønn.
- Sett platen i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 12-16 timer.
- Legg MTT (5 mg / ml) til brønner i hvilke celler vokser og holde borte fra lys i 4 timer ved 37 ° C.
- Sentrifuger celleplaten i 10 minutter ved 168 x g.
- Fjern supernatanten og tilsett 100 mL DMSO per brønn.
MERK: Vær forsiktig. Ikke berør nålen-formet dye krystaller. - Rist platen i 10 minutter ved lav hastighet for å fullstendig oppløse krystallene.
- Mål absorpsjon ved 570 nm etterved hjelp av en mikro spektrofotometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under prosessen for transformasjon, er de morfologiske forandringer av cellene visualisert ved lysmikroskopi (figur 2). Små klynger av celler ble klart synlig med det densitetsgradient separasjonsfremgangsmåten etter 7 dager etter infeksjonen, mens bare et tykt lag av cellefragmenter er synlig fra den røde blodcellelysemetode. Men lymfoblastoide cellegruppene er synlige under tykke lag av cellefragmenter 30 dager etter infeksjon. Med mer hyppig utskiftning av medium, celleavfall reduseres og de cellegruppene er godt synlige og presentere det samme bildet etablert av den tetthets-gradient separasjonsmetode.
Når cellelinjer ble etablert med hell, ble MTT-test som benyttes for å vurdere levedyktigheten til B-LCLer. Ifølge litteraturen 17, B-LCLer etablert ved forskjellige metoder valgt for å detektere cellenes levedyktighet og 1640 medium ble anvendt som blindprøve. Dataene indikerer at cellelevedyktigheten av B-LCLer etablert med den røde blodcellelysemetoden er vesentlig høyere enn cellelevedyktigheten av B-LCLer fra densitetsgradient separasjonsmetode (figur 3).
Figur 1. Flytskjema prosedyre. Anticoagulant blod behandles med røde blodcellelysebuffer før EBV-infeksjon etterfulgt av tilsetning av CsA. De infiserte B-celler blir dyrket ved 37 ° C i nærvær av 5% CO2 for å etablere og deretter utvide B-LCLer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Visualisering av Cellular morfologiske endringer i prosessen med EBV Transformation. Den venstre er B-LCLer etablert av røde blodcellelysemetode med 0,5 ml perifert blod, og celleavfall avtar etter som tiden går. Den høyre viser cellelinjer etablert av den tetthets-gradient separasjonsmetode med 2,5 ml blodprøve. Scale bar er 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av celleviabilitet for B-LCLer Etablert av ulike metoder. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SD. Resultatene viser at det ikke var signifikant forskjell mellom de to fremgangsmåter (p = 0,014). Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver utviklingen av en ny fremgangsmåte for å udødeliggjøre humane B-celler fra fullblod ved å lysere røde blodceller, og dens cellelevedyktigheten av etablerte B-LCLer ble bedømt ved MTT-assay. Resultatene viste at cellelevedyktigheten av B-LCLer er etablert av det røde blodcellelysemetoden er mye høyere enn den til den densitetsgradient separasjonsmetode. Den store fordelen med den røde blodcellelysemetode er at den er enkel og krever et lite volum (så lite som 0,5 ml) av blod for å etablere en permanent cellelinje med en høy suksessrate og høy cellelevedyktighet.
Bare en enkel lyseringstrinn er nødvendig før EBV-infeksjon. Uten foregående rensing av lymfocytter, er celletap og celleskader unngås. En annen hindring av densitetsgradienten separasjonsmetode er hemolyse. Behandling av blod etter lang tids lagring på upassende temperaturer og risting under transport kan føre til hemolyse, which vil i stor grad påvirke isolasjon av lymfocytter. Andre studier har vist at bruk av røde blodceller (RBC) lysering resulterte i et høyere antall levedyktige PBMC enn bruk av densitetsgradienten separasjonsmetoden 18 og lymfocytt-subtyper ble ikke påvirket i det vesentlige 19. Sammenlignet med den densitetsgradient separasjonsmetode, noe som er kostbart og tungvint, er den røde blodcellelysemetode mye lettere, spesielt for behandling av et stort antall av de kliniske prøver og mer praktisk for nybegynnere.
I studien har vi foreviget 24 prøver med en 100% suksessrate ved hjelp av røde blodcellelyse metode. Sammenlignet med 90-94% av suksessraten rapportert av cryopreserved lymfocytter og nylig isolerte lymfocytter 20 med 2 - 2,5 ml blod, dette er suksessraten mye høyere. I mellomtiden har vi også transformert frisk (0,5 ml) eller frosset (til og med 1 ml) blod som beskrevet i henvisningene 14,15 uten separasjon, og den efficienCY for transformasjon er mye lavere enn det som er rapportert 16 (data ikke vist).
Den foreliggende strategi ikke bare forbedrer immortalisering effektivitet i betydelig grad, men også reduserer volumet av blod som kreves for å etablere B-LCLer. Dagens teknologi for EBV transformasjon bruke relativt store volumer av perifert blod, ca 2 - 2,5 ml blod 20 for å isolere lymfocytter, mens andre krever 10 ml eller mer 10,21. Dette er i motsetning til 0,5 ml helblod som trengs for å oppnå en immortalisert cellelinje med metoden som er beskrevet her. Denne fremgangsmåten kan modifiseres for å kunne udødelig blod oppsamlet fra finger pricks 12, som kan i stor grad lette bevare genetiske ressurser fra pediatriske pasienter og eldre.
I tillegg er cellelevedyktigheten av B-LCLer er etablert av det røde blodcellelysemetoden er høyere enn den for densitetsgradient separasjonsmetode. Den røde blodlegemer lysis fremgangsmåte unngår den mekaniske sentrifugalkraften i ferd med tetthetsgradient-sentrifugering, noe som fører til uopprettelige skader på cellene. Det tyder på at den røde blodcellelysemetoden er mer egnet for genetiske og funksjonelle studier, som krever et stort antall av celler så raskt som mulig. Vår metode vil redusere tiden fra kultur initiering til nedfrysing, som vil spare ressurser og redusere arbeidskraft.
En mulig begrensning av det røde blodcellelysemetoden er tilstedeværelsen av forurensende rester som fås fra røde blodcellelysatene, noe som ville blokkere klar observasjon av endringen i de fire første ukene av EBV-infeksjon. Imidlertid vil dette avfall bli gradvis fjernes sammen med de mellom endringer. En annen begrensning er tap av voksende transformerte celler, men dette kan bedres ved å fjerne halvparten av supernatanten i de fire første ukene av transformasjon. En annen mulig modifikasjon å fjerne urenheter er merhyppige endringer medium med større volum eller vasking av cellelinjer to ganger med 10 ml 1 x PBS og deretter sentrifugering ved 168 xg i 5 minutter for å fjerne urenheter.
Oppsummert gir dette protokollen en enkel strategi for å etablere B-LCLer med høy immortalization effektivitet, reduserer blodvolum og sparer tid mellom initiering og nedfrysing. Cellelinjene som er utviklet i den foreliggende undersøkelsen gir en verdifull og kostnadseffektiv kilde av biomaterialer utføre ulike studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | SN263839 | For measuring the absorbance |
| 96 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3599 | Polystyrene plates |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25 cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of B-LCLs medium |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 31800-022 | For B-LCLs medium |
| L-Glutamine | Amresco | 0374 | Component of B-LCLs medium |
| 100x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of B-LCLs medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| PHA-M | Sigma | L8902 | For stimulating lymphocyte proliferation |
| Cyclosporin A | Cayman Chemical | 12088 | For inhibiting the cytotoxicity effect of T cells |
| Red cell lysis buffer | Tiangen | RT122-01 | For lysing red blood cell |
| MTT | Amresco | 0793 | For the detection of cell viability |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
References
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J. Gene expression profiling of lymphoblastoid cell lines from monozygotic twins discordant in severity of autism reveals differential regulation of neurologically relevant genes. BMC Genomics. 7, 118 (2006).
- Toda, T., Sugimoto, M. Proteome analysis of Epstein-Barr virus-transformed B-lymphoblasts and the proteome database. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 787 (1), 197-206 (2003).
- Chiorazzi, N., Wasserman, R. L., Kunkel, H. G. Use of Epstein-Barr virus-transformed B cell lines for the generation of immunoglobulin-producing human B cell hybridomas. J Exp Med. 156 (3), 930-935 (1982).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Hussain, T., Kotnis, A., Sarin, R., Mulherkar, R. Establishment & characterization of lymphoblastoid cell lines from patients with multiple primary neoplasms in the upper aero-digestive tract & healthy individuals. Indian J Med Res. 135 (6), 820-829 (2012).
- Neitzel, H. A Routine Method for the Establishment of Permanent Growing Lymphoblastoid Cell-Lines. Hum Genet. 73 (4), 320-326 (1986).
- Oh, H. M., et al. An efficient method for the rapid establishment of Epstein-Barr virus immortalization of human B lymphocytes. Cell Prolif. 36 (4), 191-197 (2003).
- Louie, L. G., King, M. C. A Novel-Approach to Establishing Permanent Lymphoblastoid Cell-Lines - Epstein-Barr-Virus Transformation of Cryopreserved Lymphocytes. Am J Hum Genet. 48 (3), 637-638 (1991).
- Tremblay, S., Khandjian, E. V. Successful use of long-term frozen lymphocytes for the establishment of lymphoblastoid cell lines. Clin Biochem. 31 (7), 555-556 (1998).
- Reidy, J. A., Wheeler, V. A. Sample age and Epstein-Barr virus transformation of cryopreserved lymphocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 28 (6), 383-384 (1992).
- Amoli, M. M., Carthy, D., Platt, H., Ollier, W. E. R. EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidemiol. 37, suppl 1 41-45 (2008).
- Lacelle, C., Wang, E. Establishing lymphoblastoid cell lines from frozen blood of extremely old individuals. Mech Ageing Dev. 123 (10), 1415-1418 (2002).
- Tohda, H., Oikawa, A., Kudo, T., Tachibana, T. A greatly simplified method of establishing B-lymphoblastoid cell lines. Cancer Res. 38 (10), 3560-3562 (1978).
- Ventura, M., et al. Use of a Simple Method for the Epstein-Barr Virus Transformation of Lymphocytes from Members of Large Families of Reunion Island. Hum Hered. 38 (1), 36-43 (1988).
- Chenevixtrench, G., Kerr, B., Walters, M. Lymphoblastoid Cell-Lines from Frozen Whole-Blood - a Quick and Economical Safeguard for Linkage Analysis. Am J Hum Genet. 46 (1), 635-636 (1990).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-Examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell-Growth Cell Kill. J Immunol Methods. 119 (2), 203-210 (1989).
- Bogoslovsky, T., et al. Preservation and enumeration of endothelial progenitor and endothelial cells from peripheral blood for clinical trials. Biomark Med. 9 (7), 625-637 (2015).
- Ambach, A., Bonnekoh, B., Gollnick, H. Routine flow cytometric immuno-staining of T-cell perforin is preserved using diethylene glycol for erythrocyte-lysis but lost by the use of ammonium chloride. Exp Dermatol. 12 (6), 825-831 (2003).
- Beck, J. C., Beiswanger, C. M., John, E. M., Satariano, E., West, D. Successful transformation of cryopreserved lymphocytes: A resource for epidemiological studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 10 (5), 551-554 (2001).
- Tosato, G., Cohen, J. I. Generation of Epstein-Barr Virus (EBV)-immortalized B cell lines. Curr Protoc Immunol. , Chapter 7, Unit 7 22 (2007).
