Introduction
在临床诊断中,这是由该技术的固有敏感性限制磁共振成像(MRI)的重要性日益增加,已导致在研究的快速增长到新的基于钆的造影剂(GBCAs)1的开发。 GBCAs是被给药,以提高图像质量的分子,并且它们通常具有配位的多齿配体的三价钆离子(钆3+)的化学结构。这络合作为未螯合的Gd 3+是有毒至关重要;它已经牵涉于肾源性系统纤维化的一些患者的肾疾病或衰竭2的开发。因此,检测该水性自由离子是确保GBCAs的安全工具。未螯合的Gd 3+的GBCA溶液存在往往是在配体和离子的复合物的解离,或者displacemen之间不完全反应的结果其他生物金属阳离子3吨 。
在目前用于确定的Gd 3+,那些在通用性和适用性4方面依靠色谱法和/或光谱法秩最高的存在下的几种技术。在他们的优势是较高的灵敏度和准确度,分析各种样品基质(包括人血清5,尿液和头发6,废水7和造影剂配方8),和多个钆3+络合物的同时定量(一个列表的能力的研究之前,2013是在全面审查Telgmann 等人 )4所述。唯一的缺点是,一些这些方法需要仪器仪表(如电感耦合等离子体质谱)4,一些实验室可能无法访问。在小说GBCA发现在研究和论证的概念层面,AR上下文elatively更方便,快速和成本有效的基于分光法(如紫外吸收或荧光)可以作为一种有价值的替代。考虑到这些应用中,水的Gd 3+的荧光基于适体的传感器被开发9。
适体(钆适体)是与通过指数富集(SELEX)9的配体的系统进化的过程中分离出的碱基序列特异性的44碱基长的单链DNA分子。适应适体为荧光传感器,荧光团被连接到线料,然后将其与经由13互补碱基( 图1)淬火链(QS)杂交的5'末端。了QS标记有在3'末端的暗淬灭剂分子。在不存在的Gd 3+,所述传感器(钆传感器)的,由1:分别钆适体和QS的2摩尔比,将具有最小的荧光发射是由于吨从荧光基团淬灭Ø能量转移。在加入含水的Gd 3+的将从钆适体置换的QS,从而增加荧光发射。
图 1. 传感器(GD-传感器),由标有荧光素(荧光基团),并标有DABCYL 13个碱基长的淬链(QS)的44个碱基长的适体(GD-适体)(暗淬灭剂)的。在不存在未螯合的Gd 3+的,传感器的荧光是最小的。与另外的Gd 3+的,发生的QS位移和增加的荧光发射是观察。 请点击此处查看该图的放大版本。
有目前,人们常用的基于分光法检测ING水的Gd 3+。该测定使用了分子二甲酚橙,其经历在其最大吸收波长从433至573纳米时螯合离子10的换档。这两个最大吸收的比率可以用来量化未螯合的Gd 3+的量。适体传感器是一种替代(也可以是互补的),以在二甲酚橙法,因为这两种方法具有不同的反应条件(如pH值和所使用的缓冲溶液的组合物),目标的选择性,定量的线性范围,和检测方式9。
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Protocol
注:分子生物学级水在所有的缓冲和解决方案的准备工作时使用。所有一次性管(离心及PCR)和枪头是DNase-和无RNA酶的。请咨询使用前的所有化学品的材料安全数据表(MSDS)。强烈推荐合适的个人防护装备(PPE)的使用。
1.适体母液的制备
- 购买2股多脱氧核苷酸的市场。通过高效液相色谱法(HPLC)命令与纯化两条链。
串1(GD-适体):
5' - / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
链2(QS):
5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3' - 溶解每条链在水中使钆适体和的QS100μM的个别储备溶液。
- 存放于-20°C这些解决方案。该溶液是稳定的迄今,为3年。
- 为了尽量减少FREEZ电子解冻周期,存储解决方案,股价在10微升等分。
2. 2倍的Gd-传感器溶液的制备
- 制备测定缓冲液(20mM HEPES,2mM的MgCl 2的,150毫摩尔NaCl,5mM的KCl)中。调整用NaOH和HCl pH值至7.4〜,并通过一次性无菌瓶顶过滤器具有0.2微米PES膜过滤器。存放在无菌瓶中。如果过滤,并妥善保存(在常温下),缓冲稳定到目前为止,2年。
- 稀释钆适体原液(从步骤1.2)在测定缓冲液497微升和QS原液(从步骤1.2)的2微升1微升。拌匀,用旋涡。其在2×钆传感器溶液浓度是200和400nm,分别。
注意:在此步骤中制备的2倍的Gd-传感器溶液的体积为500微升,这是足以测试6 - 7不同浓度的Gd 3+的校准曲线和造影剂溶液(步骤3)。每个样品将在384孔板给复孔。- 根据需要被测试的Gd 3+解的数目调整2倍的Gd-传感器溶液的体积。
- 转移2×钆传感器溶液到9的PCR管,用50微升到每个管中。放置管在热循环仪。
- 在热循环仪设置程序以加热在管至95℃的溶液中,保持5分钟,然后经〜15分钟缓慢地冷却该溶液至25℃(以速率〜0.05 - 0.1℃/ S)。加热和冷却循环是确保钆适体和QS之间最佳杂交。部分杂交结果不完全淬火和传感器的一个更高的背景荧光。如果热循环仪是不可用,进行利用热水浴代替这个过程。
- 一旦冷却到25℃,立即使用该溶液,或保持在热循环仪(最高达约2小时),直到准备好是用过的。当水浴用于加热,离开该管在浴中当水慢慢冷却到室温。
3.构建荧光校准曲线和钆造影剂的溶液检测未螯合GD的存在3+
- 溶解GdCl 3在测定缓冲液固体(相同的缓冲液如在步骤2.1)。
- 通过连续稀释,在最终所需浓度的校准曲线(2×溶液)的双制备各6个不同的Gd 3+在微量离心管溶液100微升。
- 例如,为了构建一个校准为0,50,100,200,400(仅无GdCl 3缓冲液),和钆3+为800nm,制备含有0,100,200,400,800,和1600纳米的解决方案的离子。确保始终包括“空白”0纳米的Gd 3+作为阴性对照。
- 溶解造影剂是测试编在测定缓冲液中。准备2个或3个不同的浓度通过连续稀释的造影剂的解决方案。
注:测试3种不同浓度造影剂溶液的建议。这是为了确保这些浓度的线性范围内。如果测试没有显示线性关系的样品中,减少造影剂的浓度使用。 - 服用含有从步骤2.5 2倍的Gd-传感器解决方案出来的热循环仪的PCR管。
- 添加来自步骤3.2的每个的Gd 3+溶液的50微升到含有2倍的Gd-传感器溶液9 PCR管6。吹打向上和向下混合。每个PCR管现在包含钆3+的所需浓度进行测试,100nM的钆适体,和200nM的QS。
- 到含有2倍的Gd-传感器溶液剩余的PCR管,从步骤3.3添加造影剂溶液的50微升。通过上下吹打几次拌匀。
- 孵育在Solutions在PCR管在室温下约5分钟。它们可以被放置长达30分钟。
- 传送每个管的45微升到384孔板中。每个PCR管会给重复孔中。
- 记录的每个孔中的荧光在平板阅读器。在GD-传感器设计中使用的荧光团(FAM),分别有495和520 nm的激发和发射最大值,对供应商的网站上所列出。选择取决于在板阅读器是否monochromator-或基于过滤器的合适的激发和发射波长或过滤器。
- 绘制荧光任意荧光单位(AFU)对钆3+的浓度曲线图。
- 画出图作为对抗的Gd 3+的荧光浓度倍数变化。由“空白”解决方案的AFU(0纳米的Gd 3+)将每个浓度的AFU计算荧光倍数变化。荧光倍数变化将使n个结果ormalization,应AFU显示一些周期性的(不同天等 )的变化。
- 比较含有造影剂的溶液和“空白”,它是含0纳米GdCl 3(仅缓冲)该溶液的荧光发射。
注:GBCA溶液的更高的荧光意味着未螯合的Gd 3+的存在,这可能需要造影剂的进一步纯化。未螯合的Gd 3+的存在量可以利用在步骤3.10或3.11构建的校准曲线来估算。
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Representative Results
在未螯合的Gd 3+的存在下的Gd-传感器溶液的典型荧光变化示于图2。发射可被绘制为荧光倍数变化( 图2A)或在原始荧光读数( 图2B)以任意单位(AFU)。两条曲线在> 3μM收率低于1μM和饱和信号的线性范围为钆浓度3+非常相似的校准曲线。检测限为〜100纳米带3的信噪比。
在含有感兴趣的GBCA溶液,未螯合的Gd 3+的存在将被翻译成的传感器的荧光增加时相比,“空白”的解决方案。在钆DOTA复杂,比其他更高纯度之一的2个不同批次的解决方案的荧光的变化,是显示n作为的代表性结果的例子( 图3)。钆DOTA(gadoteric酸)是钆的钆络合物3+由在市售的造影剂中的有机配位体的DOTA包围。较高纯度的批料不显示在排放到钆DOTA的20mm的显著增加。当未螯合的Gd 3+存在,这一变化是明显的,即使在低于5毫米的Gd-DOTA浓度观察。在本实施例,其中数据点被绘制作为传感器的荧光的倍数变化,未螯合的Gd 3+的量的定量可以使用图2A中的校准曲线来估算。
图2. 代表钆荧光传感器的校准曲线图。至少在重复进行所有的数据点,平均值情节泰德与标准偏差为误差线。使用100纳米的Gd-适体和200纳米QS(A)得到的校正曲线。图形绘制荧光倍数变化为y轴。 (B)相同的校正曲线中(A)和以任意单位(AFU)为y轴原始荧光。 请点击此处查看该图的放大版本。
在钆DOTA分子的样品 测试未螯合的Gd 3+ 的存在下时 图3 代表钆传感器荧光变化 。钆DOTA复杂的解决方案的两个不同批次示于该图,更高的纯度(圆标记),另一种含有未螯合的Gd 3+中的一个(蓝色trianglË标记)。每个数据点是两次读数与标准偏差作为误差线的平均值。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
使用基于适体的Gd-传感器,荧光发射的增加正比于观察未螯合的Gd 3+的浓度。为了最大限度地减少样品的使用量,该测定可以在384孔微量板以每孔45微升总样品体积运行。在此设计中,荧光素(FAM)和DABCYL(DAB)的选择主要基于试剂的成本;修改发射波长的荧光团不同的配对和猝灭剂,可以使用11。
要注意的是,以获得与该传感器最好的结果是很重要的,过程的关键步骤是在该测定缓冲液加热至95℃,并缓慢冷却(步骤2.4)来实现的Gd-适体和QS之间最佳杂交链。如先前在协议中提到,如果一个热循环仪是不可用,在95℃下温育可以在水浴中进行。控制另一个关键参数为t他组成的缓冲溶液;建议使用在步骤2.1以溶解造影剂所列出的测定缓冲液中,或者也可以使用去离子水。然而,应避免含有潜在干扰物的解决方案。这样的缓冲液的一个例子是一个包含磷酸根阴离子,其可以协调对未螯合的Gd 3+形成不溶性的钆磷酸盐12。该沉淀物将不与传感器反应,导致假阴性结果。
在实验中的一些步骤可以在不影响的结果进行修改。首先,为了简化分析和计算,需准备的Gd-传感器溶液和GdCl 3为以2倍浓度的校准曲线含水两者。如果需要的话,其它的稀释因子可以被使用(例如,10倍溶液),条件是钆适体的最终测定浓度和QS分别保持在100纳米和200纳米。第二,该测定缓冲液DOES不必是准确的pH 7.4。 7之间的任何值 - 7.4将产生所需的荧光增加,只要相同的缓冲液在整个实验中使用。第三,一旦获得荧光发射读数,数据点可被绘制或者作为在任意单位(AFU)原始荧光或荧光的倍数变化。计算荧光倍数变化,各浓度的原始荧光读数标准化为(除以)阴性对照(0纳米的Gd 3+)的读取。如在图2A和B中所示,在两个重复的荧光发射的趋势是几乎相同的。倍数变化可以是对数据进行分析的更方便的方法,如果板器显示在记录在不同的时间原始读数的一些变化。最后,如果实验室装备有荧光计,但不是一个读板器中,每个数据点可以使用比色皿测定,代替微板。根据大小OF中的可用的试管,在测定制得的溶液的体积,可能需要进行调整。
本文所报道的方法提供了一种替代chromatographic-和/或用于检测水的Gd 3+基于光谱的技术。相比于后者,钆传感器测定是在对多个物种的同时检测灵敏度,准确度和能力方面的更多的限制。另一方面,基于分光传感器需要的仪表可能可能是更容易获得,可以在更短的时间内进行,样品的准备是最小的。造影剂可以简单地溶解在缓冲溶液中,用钆传感器溶液混合,并直接测量荧光发射。此外,传感器能够检测未螯合的Gd的低得多的浓度3+比二甲酚橙指示剂(约2个数量的两种方法之间数量级的差别),并具有一对于钆3+几个其他重要的生物和过渡金属离子9较高的选择性。
有该测定可能限制某些实验条件下它的使用的两个缺点。一个限制是,该传感器不是特定为钆3+;其显示给其他镧系元素离子(如铕和铽 )9的响应。然而,这些都不是在造影剂通常发现或离子的生物系统,因此,它们的干扰是最小的。第二点要注意的是,在较高浓度(大于〜10μM)的Gd 3+,在钆传感器荧光发射逐渐降低的观察。淬火通过镧系元素离子的效果是,也被用作用于检测和定量这些14的技术的详细记录现象13。而这限制了传感器的效用,用于测量高浓度的Gd 3+
在这项工作中,使用了在水溶液中检测的毒性未螯合的Gd 3+的便利基于荧光的技术已被描述。该测定是为基于钆的造影剂纯度的早期阶段的评价,特别是在合成和配制用于体外实验。在诊断的磁共振成像的当前的增长,越来越多的新的造影剂的不断被设计和测试。基于核酸适体的Gd-传感器将通过提供一种用于在环境pH值快速检测的未反应或解离的Gd 3+水溶液亚微摩尔浓度的存在的手段促进这一发展。此外,由于传感器显示交叉反应性与其他的三价镧系元素离子,其应用可以是扩展到这些研究领域。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gd-aptamer | IDTDNA | Input sequence and fluorophore modification in the order form | A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
Quenching strand | IDTDNA | Input sequence and quencher modification in the order form | A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company. |
Molecular biology grade water | No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well | ||
Gadolinium(III) chloride anhydrous | Strem | 936416 | Toxic |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Magnesium chloride anhydrous | MP Biomedicals | 0520984480 - 100 g | |
Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P333-500 | |
Sodium hydroxide, pellets | Fisher Scientific | BP359 | Corrosive |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Toxic and corrosive |
384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates | Corning | 3575 | Plates which are suitable for fluorescence reading are required. |
Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter | Thermo Scientific | 5680020 | The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane |
Disposable sterile bottles 250 mL | Corning | 430281 | A larger or smaller bottle may be used |
1.5 mL microcentrifuge tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
0.2 mL PCR tubes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
Micropipets | No specific manufacturer | ||
Pipet tips (non filter) of appropriate sizes | No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free | ||
Equipment | |||
Plate reader | Biotek Synergy H1 | Plate readers from other manufacturers would work equally well |
References
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