Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

נוהל מקיף כדי להעריך את Published: March 4, 2017 doi: 10.3791/55271
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 1, 2, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Translational and Molecular Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Abstract

בהשראת ההצלחה של ננו-רפואת הסרטן הקודם במרפאת, חוקרים יצרו מספר רב של ניסוחי רומן בעשור האחרון. עם זאת, רק מספר קטן של ננו-רפואה אושר לשימוש קליני, ואילו רוב ננו-רפואה בפיתוח קליני הניבו תוצאות מאכזבות. מכשול עיקרי אחת לתרגום הקליני המוצלח של ננו-רפואת הסרטן החדש הוא חוסר הבנה מדויקת של ביצועי in vivo שלהם. מאמר זה כולל הליך קפדני על מנת לאפיין את התנהגות in vivo של ננו-רפואה בעכברים נושאי גידול ב מערכתית, רקמה, תא בודד, ורמות subcellular באמצעות שילוב של טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה ממוחשבת (PET-CT), שיטות כימות רדיואקטיביות , cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בגישה זו, חוקרים יכולים להעריך ניסוחי ננו רומן במדויק בעכברי מודל רלוונטי של Cancer. פרוטוקולים אלה עשויים יש את היכולת לזהות את ננו-רפואת הסרטן המבטיח ביותר עם פוטנציאל translational גבוה או כדי לסייע אופטימיזציה של ננו-רפואת הסרטן לתרגום בעתיד.

Introduction

ננו-רפואה היא הסטה הפרדיגמה של פיתוח טיפול בסרטן 1. בהשראת ההשפעה הקלינית העצומה של ננו-רפואת הסרטן הקודם, כגון liposome- ו nanotherapies מבוסס אלבומין 2, 3, ניסוחי רומן רבים הופקו בעשור האחרון. עם זאת, הניתוחים האחרונים של הצלחת התרגום הקלינית של ננו-רפואת הסרטן אלה עולים, כי רק מעטים מהם אושרו לשימוש קליני 4, 5. מכשול עיקרי אחת לתרגום הקליני של ננו-רפואת הסרטן החדש הוא השיפור המוגבל שלהם של החלון תרפויטי לעומת הממשל הישיר של התרכובות הטיפוליות בחינם 6. כפי הערכתנו, מדויקת של ביצועי vivo של ננו-רפואה בבית, רקמה מערכתית, ורמות הסלולר במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים חיוני identify בעלי מדדה טיפולי אופטימלי לתרגום קליני עתידי.

ננו יכול להיות רדיואקטיבי לאפיון כמוני לחיות חיים עם הדמיה טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET), אשר יש רגישויות שחזור מעולות בין כל שיטות ההדמיה הקליניות 7. לדוגמא, 89 Zr שכותרתו לטווח במחזור ננו-רפואה מתאפיינת בעכברי מודל לסרטן 8, 9, 10, כמו גם במודלי מחלה אחרים 11. בנוסף, הדם מחצית החיים biodistribution של ננו-רפואה ניתן להעריך באופן נרחב באמצעות מדידות קרינה רדיואקטיבית vivo לשעבר ברקמות בודדים 8. לכן, radiolabeling מאפשר הערכה כמותית של ננו-רפואה ברמות מערכתיות ורקמות.

חשוב לציין, radiolabeleננו-רפואה ד כלל לא ניתן לנתח על-התא הבודד או רמות subcellular בשל ברזולוציה מרחבית המוגבלת של האות רדיואקטיבי. לכן, תיוג פלורסנט מוכיח להיות אפנות משלימים עבור ההערכה של חלקיקים עם טכניקות הדמיה אופטיות כגון cytometry זרימת הקרינה מיקרוסקופיה 12. לשם כך, חלקיקים שכותרתו עם ברדיואיזוטופים תגי פלורסנט ניתן להעריך כמותית in vivo על ידי הדמיה גרעינית לשעבר vivo על ידי ספירת רדיואקטיביות, והם יכולים גם להיות מאופיינים בהרחבה ברמה התאית על ידי הדמיה אופטית.

בעבר, פיתחנו נהלים מודולרית לשלב תוויות רדיואקטיבי פלורסנט לתוך חלקיקים שונים, כולל ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) 11, ליפוזומים 9, 10, חלקיקים פולימריים, שברי נוגדנים, ו nanoemulsions 10, 13. חלקיקים אלה שכותרתו אפשרו לאפיון כמוני במודלים של בעלי חיים רלוונטיים ברמות שונות, אשר הנחו את אופטימיזציה של ננו אלה עבור היישומים הספציפיים שלהם. במחקר הנוכחי, המטרה היא להשתמש חלקיקים-the liposomal פלטפורמת ננו-הרפואה ביותר שהוקם 14 -as דוגמא להפגין נהלים מקיפים כדי ליצור ננו-חלקיקים כפולים שהכותרת ולאפיין אותו ביסודיות במודל של עכברי B16-F10 מלנומה syngeneic קלסי 15 . מהתוצאות, אנו בטוחים זה גישת אפיון nanoparticle ניתן להתאים להעריך ננו-רפואת הסרטן אחר בעכברי מודל רלוונטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההליך מורכב של תיוג רדיואקטיבית פלורסנט כפול של חלקיקים, in vivo הדמיה PET-CT, מדידות biodistribution vivo לשעבר, לשעבר vivo immunostaining וזרימה cytometry מנתח. כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש של מרכז הסרטן ממוריאל סלואן קטרינג.

1. הכנה ליפוזומים שכותרתו הכפולה

הערה: גידולים מלנומה B16 syngeneic יכולה להיגרם על ידי הזרקת תאי 300,000 B16-F10 בירכיו האחוריות של C57BL / 6 עכברים בהרדמת משאיפת 2% -isoflurane המכיל חמצן. השתמש ריאגנטים וכלים סטריליים סביבת עבודה סטרילית במהלך הניתוח. לאחר הניתוח, אנא קראו בעיון את החיות עד להחלמה שלהם מן ההרדמה. מכניסים את החיות בחזרה אל תוך הכלובים שלהם רק כשהם להכרתו וניידות מלאה. לשכן אותם בחדרים סטריליים חיות עם גידולים xenografted. גידולים עם גודלשל 300 מ"מ 3 הם אידיאליים לאפיון ננו-חלקיקים בשל התופעות החדירות ושימור המשופר המבוטאות שלהם (EPR), אשר יכול להגביר את הצטברות ננו-חלקיקים. הפרוטוקולים המפורטים מובאים בהמשך.

  1. בבקבוק מסביב לתחתית, לפזר תערובת של 20 מ"ג של שומנים 2 מ"ל של כלורופורם המכילים 1,2-dipalmitoyl- SN -glycero-3-phophocholine (DPPC), כולסטרול, 1,2-disearoyl- SN -glycero- 3-phosphoethanolamine-פולי (אתילן גליקול) 2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-deferoxamine (DSPE-DFO) 8, וחומצה 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonic ( DiIC12 [5] -DS) על יחסים טוחנים של 61.3%, 33.4%, 5, 0.2%, ו -0.1%, בהתאמה.
    הערה: רכב שומנים זה דומה מאוד לניסוח liposomal של דוקסורוביצין המשמש כיום את המרפאה 2. ליפוזומים נובע ההליך שלנו יעקבו מקרוב לחקות את הביצועים ב vivo של nanomedic הקליניine.
  2. השתמש מאייד סיבובי כדי להסיר את הממס האורגני ויוצר סרט שומנים דק בטמפרטורת חדר. הוסף 20 מ"ל של PBS sonicate במשך 30 דקות כדי ליצור חלקיקים liposomal באמצעות טיפ sonication 3.8 מ"מ אמפליטודה של 30 וואט, עם קירור מספיק על הקרח.
  3. צנטריפוגה הפתרון liposome ב 4000 XG במשך 10 דקות כדי להסיר את אגרגטים לשטוף חלקיקים עם PBS באמצעות סינון צנטריפוגלי (משקל מולקולרי חתוכים (MWCO:. 100 KDA) כדי להסיר שומנים בחינם ממיס אורגני שיורית לרכז את ליפוזומים, אשר יהיה להישאר בתא העליון, ולהעבירם צינור חדש. ניתן לאחסן ליפוזומים בתוך מקרר ב PBS עד 1 שבוע לפני הצעדים הבאים.
  4. עבור בקרת איכות, לאפיין את ליפוזומים ידי פיזור אור דינאמי (DLS). באופן ספציפי, לערבב 50 μL של ליפוזומים עם 950 μL של PBS, ולאחר מכן להעביר את התערובת לתוך קובט האומדת. מניחים את קובט ב הנתח ולמדוד את החלקיקיםבגדלים והפצת גודלם. גדלי החלקיקים והפצת גודל היישוב (מדד polydispersity (PDI)) צפויים להיות 90 - 120 ננומטר ו -0.1 - 0.2, בהתאמה.
  5. לקבלת radiolabeling, לערבב את ליפוזומים מטוהרים, שווה ערך ל 2 מ"ג של שומנים, ב- PBS ב- pH בין 6.9 ו -7.1 עם 1 MCI 89 ZR-אוקסלט ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב צינור 1.5 מ"ל, (הנפח הכולל: ~ 100 μL). הסר את בחינם, unreacted 89 Zr ידי סינון צנטריפוגלי (MWCO = 100 KDA), בדומה לשלב 1.3. שטפו את retentate עם PBS סטרילית לדלל אותו אל העוצמה הרצויה. תשואת radiochemical צריכה להיות 80 - 95%.
    זְהִירוּת! עבודה עם חומרים רדיואקטיביים הוא פיקוח הדוק. מוסדות חייבים להיות מוסמכים ולספק את המתקנים דרושים, אימון כוח אדם, וניטור קפדני שימוש רדיואקטיביות. חוקרים צריכים לקבל הכשרה מתאימה ללבוש ציוד וטבעות dosimetry מגן אישיים / תגים בעת טיפול רדיואקטיביות.
    6. 10. purities Radiochemical הנמוך מ -95% מעיד על כביסה מספיק על שלב 1.5.
  6. לאחר radiolabeling, לקבוע את הגודל של החלקיקים על ידי פיזור אור דינאמי. הגודל PDI צפויים להיות בתוך אותו טווח המדידות בשלב 1.4 10.
    הערה: אם דגימות רדיואקטיבי אינם מורשים להיכנס cytometer את הזרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שאינם רדיואקטיביים NAT ZR-אוקסלט ניתן להשתמש בתווית ליפוזומים בשלב 1.5. יש ליפוזומים שאינם רדיואקטיביים אלה מאפיינים זהים אנלוגים רדיואקטיבי שלהם. תיאור של הליך זה מסופק באיור 2.

2. Vivo PET-CT הדמית biodistribution של ליפוזומים כפולים שכותרתו

  1. להזריק כ -100 μL של ליפוזומים כפולים שכותרתו wה- i כ -300 μCi של רדיואקטיביות לעכברים מלנומה מאופק (C57BL / 6, נקבה, 10 - 16 שבועות הישן) בוורידים הזנב שלהם, בסביבות 10 MCI 89 Zr / ק"ג משקל גוף.
  2. כדי לקבוע את זמן מחצית החיים, להקיז דם מווריד הזנב מחיות הרדים מתחת 2% isoflurane המכיל חמצן באמצעות מזרקים 28-G אינסולין. אסוף את הדם (10 - 20 μL) צינורות טרום שקל ב -2 דקות, 15 דקות, 1 שעות, 4 שעות, 8 שעות, 24 שעות, ו -48 שעות לאחר ההזרקה. לשקול את הדם על ידי ההבדל, לקבוע תוכן רדיואקטיביות באמצעות מונה גמא, ולחשב ריכוז הרדיואקטיביות כאחוז מהחומר המוזרק לגרם (% מזהה / g).
    הערה: בצע את ההליך בחדר מצויד במערכת הרדמה, כלובי התאוששות, חימום, וברדס Biohazard. ודא כי בעלי החיים באופן מלא להתאושש ולהשיג ניידות נורמלית לאחר ההליך לפני העביר מכלובי התאוששות כדי להחזיק בכלובים. בית חי נושאות הגידול בחדרים המיועדים לבעלי חיים מנוהלים עםחומרים רדיואקטיביים.
  3. 24 או 48 שעות לאחר ההזרקה של ליפוזומים, תמונה העכברים בתוך סורק MicroPET-CT קטן-חיה 10. מניח את החיה הרדימה אופקי על הבטן שלה ולשמור אותו בהרדמה. נהל 2% חמצן isoflurane באמצעות חרטומו. החל משחת עיניים לעיניים שלה לפני הסריקה כדי למנוע מהם הייבוש.
  4. בצע הקלטת סריקת סטטי PET גוף כולו לפחות 50 מיליון אירועים חופפים, עם משך משוער של 15 דק '. הגדר את חלון תזמון אנרגיה ומקריות ב 350-700 קאב 6 ננו-שניות, בהתאמה. לאחר מכן, לבצע טומוגרפיה ממוחשבת של 5 דקות סריקה (CT). הגדר את שפופרת רנטגן למתח של 80 קילו וולט וזרם של 500 מיקרו-אמפר; בדיקת ה- CT משתמשת 120 צעדי סיבוב עבור סכום כולל של 220 מעלות, עם כ 145 מילישניות לכל מסגרת 10.
  5. לאחר סריקת PET-CT, מיד להקריב את העכברים בחנק פחמן דו חמצני לאשר את מותם על ידי pinching הכפות של החיות. לאחר אשר, לבצע לנקעי צוואר רחם.
  6. הסר את הדם ברקמות עכבר על ידי החיתוך הראשון פתוח אטריום ימין ולאחר מכן הזרקת 20 המ"ל PBS לתוך החדר השמאלי, ולאחר מכן לאסוף את הרקמות הרלוונטיות כגון גידולים, כבד, טחול, ריאות, כליות, שרירים, ועוד 16.
  7. לשקול את הרקמות, למדוד תוכן הרדיואקטיביות שלהם על ידי גמא לספור 8, 9, ולחשב את הצטברות רדיואקטיביות רקמות כאחוז מהחומר המוזרק לכל גרם (% מזהה / g).

3. Ex Vivo Cytometry זרימה Immunostaining

הערה: להזריק כ -100 μL של ליפוזומים פלורסנט לעכברים מלנומה דרך וריד הזנב שלהם במינון של 0.5 מ"ג של צבע לכל ק"ג ממשקל הגוף. אם דגימות רדיואקטיבי אינם מורשים להיכנס cytometer את הזרימה ואת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ליפוזומים שאינם רדיואקטיביים חייב לשמש.

  1. הקורבן לאחר ההזרקה h עכברים 24, כמו בשלב 2.5, לאסוף את הגידולים, אשר חייב להיות מאוחסן PBS קר.
  2. עבור cytometry זרימה, בצע את הפעולות הבאות 17:
    1. הכן קוקטייל אנזים המורכב מתערובת של לי collagenase מטוהרים השנייה (4 U / mL), hyaluronidase (60 U / mL), ו DNase אני (60 U / mL) בתזרים cytometry חיץ (PBS עם 0.5% BSA ו 1 mM EDTA).
    2. מערבבים 100 מ"ג של רקמת הגידול עם 200 μL של חיץ קוקטייל האנזים צינור 1.5 מ"ל לקוביות הרקמה לחתיכות קטנות עם מספריים בסדר. הוסף עוד 1.3 מ"ל של קוקטייל האנזים לתוך הצינור ולהעביר את תכולתה צלחת 6 באר.
    3. לנער את הצלחת 6-היטב על שייקר אופקי המונח בתוך תנור 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב 60 סל"ד.
    4. שטפו את homogenate רקמות עם זרימת cytometry חיץ 3 פעמים כדי לקבל השעיה תא בודד.
    5. כתם התאים עם קוקטייל של נוגדנים ספציפיים ביומרקרים כולל CD45, CD11b, Ly6C, CD11c,CD64, CD3, MHCII, ו CD31 (1: 200 דילול לכל נוגדנים; מידע שיבוט מסופק בגיליון האלקטרוני חומרים). זיהוי סוגי תאים רלוונטיים ולקבוע עוצמת הקרינה הממוצעת שלהם (MFI) של DiIC12 (5) -DS בכל אוכלוסיית תאים עם זרימה מתאימה cytometry תוכנת ניתוח.
  3. עבור immunostaining, בצע את הפעולות הבאות:
    1. מניח גידול לתוך קלטת המלאה בינוני חיתוך אופטימלי (OCT) ולהקפיא אותו על קרח יבש.
    2. הפוך חלקים קפוא 6-מיקרומטר מרקמות גידול ומניח אותם על שקופיות זכוכית היסטולוגיה; הסעיפים צריכים לכסות את בחתכים הגדולים של הגידול, אשר מספקים את מידע הנציג ביותר על הרקמה.
    3. כתם הסמנים הביולוגיים (למשל, CD31 בתאי האנדותל) של עניין עם הנוגדנים המתאימים (למשל, אנטי CD31, שיבוט MEC13.3). תקן את החלקים עם paraformaldehyde; לחסום אותם עם סרום ההתאמה ממוצא המינים של נוגדנים משני; incubאכלו עם נוגדנים ראשוניים במשך 12 שעות ב 4 ° C ולאחר מכן עם נוגדנים משני עבור 2 שעות; ולבסוף, לשטוף עם PBS ומכסה תלושים לכסות. תמונת השקופיות מוכתמות מיקרוסקופ SP5 confocal זקוף ליקה 13, 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג סקירה של ההליך. איור 2 מציג את הליך סינתזה סכמטי של ליפוזומים כפול שכותרתו כמתואר בשלב 1 10. איור 3 הינה ביטוי של PET-CT התמונה (איור 3 א), כימות רדיואקטיביות מ PET הדמיה (איור 3 ב), דם מחצית החיים (איור 3 ג), ו biodistribution (איור 3D) של חלקיקים רדיואקטיביים, כמתואר בשלב נציג 2. איור 3 א, את ליפוזומים מאוד לצבור בתוך הגידול, אשר אושר על ידי כימות של תוצאות ההדמיה 3 ב איור. יתר על כן, ליפוזומים להראות זמן מחצית חיים הדם של כ -10 שעות ב איור 3c. Biodistribution vivo לשעבר מאשר את הצטברות גידול הגבוהה של ליפוזומים. לבסוף, איור 4 מספק pr gating טיפוסיocedure לזהות תאים רלוונטיים גידול לניתוח רמת התא הבודד של הצטברות ננו-חלקיקים (איור 4 א 'וב'), אשר מציגה את ההצטברות המועדפת של ננו-החלקיקים מקרופאגים גידולים קשורים (TAM). תמונת מיקרוסקופ confocal נציג מראה גם את החפיפה בין חלקיקים ותאי האנדותל (איור 4C).

איור 1
איור 1. סכמטי סקירה כללית של הליך אפיון in vivo הננורפואה. הליך זה כולל את התיוג של חלקיקים עם תגי רדיואקטיבית פלורסנט היא; אפיון של חלקיקים radiolabeled עם הדמיה PET-CT, מדידות זמן מחצית החיים דם, והערכות biodistribution; ואת התא הבודד ואת משנה הסלולר הניתוח של חלקיקי ניאון ידי cytometry זרימה ואניmmunostaining, בהתאמה. הטכניקות, משמאל לימין, לספק הגדלת הרזולוציה המרחבית של ננו-חלקיקים בצבירת vivo. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. נוהל סינתזה של ליפוזומים כפולים שכותרתו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. נציג תוצאות של in vivo אפיון רדיואקטיבי חלקיקים. (א) תמונות PET-CT של tumor נושאות עכבר לאחר הזרקת ננו-החלקיקים ו- (ב) PET נגזרת ערכיים ספיג ברקמות מרובות (n = 3). (ג) דם רדיואקטיביות זמן מחצית החיים של ננו-חלקיק רדיואקטיבי, וכן (ד) biodistribution שלה ב 24 שעות שלאחר ההזרקה (n = 3). ברי השגיאה הם סטיית ההתקן. שונה מן ההתייחסות 8, באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. נציג תוצאות של אפיון vivo של פלורסנט חלקיקים. (א) בהליך הזרימה cytometry gating טיפוסי לזהות תאים חיסוניים גידולים הקשורים, תאים סרטניים, ותאי האנדותל (EC), וכן (ב) כימות של nanopartiהצטברות CLE בתאים אלה 8. תמונה מייצגת של 3 חזרות ביולוגיות. (ג) תמונה immunofluorescence נציג מראה את המיקוד הספציפי של nanoemulsion RGD מצומדות לתאי אנדותל בגידולים 13. שונה מן האזכור 8 ו -13, באישורו. גידול הקשורים מקרופאג (TAM). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול:

האיכות הגבוהה של ליפוזומים כפולים שכותרתו היא המפתח לייצר תוצאות עקביות על פני תקופה ארוכה של זמן. צבעי ניאון חינם או 89 יוני Zr יכולים ליצור דפוסי מיקוד שונים לחלוטין ויש להסירם לחלוטין במהלך שלב הטיהור. בנוסף, אם המערכת החיסונית באופן משמעותי משפיעה על ביצועי ננו-רפואת סרטן ניסיוני, השימוש במודלים של עכברים עם מערכת חיסון תקינים צריך להיות עדיף, כגון מודל מלנומה B16-F10 C57BL / 6 עכברים, אשר שמש בכל פרוטוקול זה. אם במייקרו-הסביבה של הגידול או שילוב מסוים של מוטציות גנטיות הוא גורם מרכזי, מודלי xenograft גידול נגזר מטופל יהיו מתאימים.

שינוי ופתרון בעיות:

ההליך שלנו מספק דרך פשוטה ואמינה כדי להעריך את הביצועים ב vivo של ננו-רפואה ב גידולים נושאיםimals. הליך זה משמש כשלד לבנות ניסויים ספציפיים לאפיין ננו-רפואת הסרטן עבור יישומים שונים. לדוגמא, חוקרים יכולים לקבוע הפרמקוקינטיקה כמותית in vivo של nanomaterial כאשר PET-CT סריקות מתבצעות בנקודות זמן מרובות באותו החיות 17; הם יכולים לאסוף מידע biodistribution של ננו ידי ניתוח ברקמות אחרות, כגון מעי גס, מעי דק, לבלב, מוח, עור, התימוס, בטן, או בבלוטות רוק, כפי שמוצגים פרסומים אחרים 18, 19, 20, 21; או שהם יכולים להעריך את הספציפיות תא הבודד ו subcellular של ננו-רפואה ברקמות רלוונטיות אחרות מאשר גידולים על ידי יישום זרימה זו cytometry ו immunostaining פרוטוקול.

מגבלות של הטכניקה:

r פרוטוקול זהequires כמה תשתית כולל מחקר מיוחדים מתקנים ו radiochemistry והדמיה מומחיות טכנית radiolabeling, הדמיה קטנים בעלי חיים, ואימונולוגיה. לכן, יוצא להורג באופן אידיאלי על ידי צוות רב תחומי של חוקרים בעלי מומחיות בתחומים הרלוונטיים. הניסיון שלנו מראה כי הביצוע האופטימלי של הליך זה מחייב תכנון קפדני ושיתוף פעולה יעילה.

ראוי לציין כי הפרוטוקולים הספציפיים וסוכנים מוצע בכתב היד הזה הם מתאימים ביותר עבור radiolabeling חלקיקי שומנים מבוססים. עם זאת, הרעיון של חלקיקים כפולים שכותרתו יכול להיות מועסק על מנת לאפיין ניסוחי nanoparticle אחרים כי הם, למשל, מבוססים על nanocrystals זהב, פולימרים, או אפילו חלקיקים נגיפיים. במקרים אלה, אסטרטגיות תיוג שונות תידרשנה. חשוב להדגיש את המגוון הרחב של איזוטופים רדיואקטיביים המשמשים להדמיה ביו, כולל 89 Zr, 18 64 Cu, 68 Ga, ו -123 I, אם להזכיר רק כמה 7. הבחירה של כורים חייבת להתבצע על בסיס המאפיינים הספציפיים של nanomaterial תחת חקירה, בעיקר זרימת דם שלה זמן מחצית חיים, כדי לאפשר אפיון מלא בנקודות זמן מאוחר יותר. עם זאת, גורמים אחרים, כגון כימית תיוג או זמין איזוטופ, עשויים להשפיע על הבחירה הסופית. לצורך המחקר, 89 Zr נבחר בגלל זמן מחצית החיים הפיסיים הארוך שלה (t 1/2 = 78.4 שעות) ניתן להשוות את דם מחצית החיים של ליפוזומים. מן ראוי לציין כי, פרוטוקול זה יכול גם להתבצע עם איזוטופים אחרים, כמו 99m Tc, 111, או 125 אני, כי הם זמינים מסחריים ומתאימים הדמיה עם טומוגרפיה ממוחשבת פליטת פוטון יחיד (SPECT). באופן דומה, DilC נבחר בשל הידרופוביות גבוהה ולכן יעילות העמסה גבוהה ליפוזומים. צבעי ניאון אחרים עם properti physicochemical שליליes ניתן מצומדות ישירות פוספוליפידים 17.

המשמעות של טכניקות:

הליך זה מציג פוטנציאל translational גבוה כאשר מותאם להעריך ננו-רפואה במחקרים קליניים. 4 טכניקות כלומר מפתח, הדמיה PET-CT, מדידת רדיואקטיביות, cytometry זרימה, אימונוהיסטוכימיה-משמשים באופן שגרתי לאבחון אונקולוגי בחולים. לכן, הליך הפרה-קליניים זה יכול להיות מתורגם בקלות להעריך את הביצועים vivo של ננו-רפואה ב השלב הקליני. יתר על כן, בגודל הגדול יותר של איברים אנושיים בהשוואה לעכברים מאפשר ניתוח מדויק יותר על ידי הדמית PET-CT 22, אשר יכול להחליף את מדידת רדיואקטיביות פולשני המבוססת על הביופסיה של הצטברות ננו-רפואה. בהגדרה זו, לא פולשנית, פרוטוקולים מונחה הדמיה ניתן לפתח לריבוד חולה וכדי לסייע homogenize תוצאה חולה 10. deveמרחיבי צעד ננו רדיואקטיבי עדיין דורש השקעת תשתית משמעותית. לחלופין, טכניקות הדמיה שאינם רדיואקטיביים מבוסס על תהודה מגנטית (MRI) היו מתפתחים במהירות בעשור האחרון. לדוגמא, הדמית חלקיקים מגנטיים (MPI) משתמשת חלקיקי תחמוצת ברזל קטנים (10 עד 20 ננומטר) ויכולה לספק הערכה כמותית הרבה יותר של ננו-רפואה שכותרתו עם חלקיקי תחמוצת ברזל in vivo מאשר טכניקות MRI הנוכחיות 23. תרגום קליני של MPI יאפשר ליותר לחוקרים להשתמש חזקים בטכניקות הדמית vivo כדי להעריך את הביצועים ב vivo של ננו-רפואת הסרטן.

יישומים עתידיים:

לאחר חוקרים לשלוט פרוטוקולים אלה, הם יכולים ליישם את הנהלים לאפיין ביותר פלורסנט כפול שכותרתו רדיואקטיבי, חומרים חדשים, כוללים פפטידים, חלבונים, נוגדנים, שברי נוגדנים, וכן הלאה. נהלים אלהיכול לעזור למדענים להעריך את in vivo הביצועים של חומרים ביו הרומן ביסודיות לזהות את אלה עם פוטנציאל translational גדול.

לסיכום, אנו שואפים להציג הליך אפיון nanomedicine מקיף שיכול לספק מערכתית, רקמה, תא בודד, ומידע הצטברות ננו-רפואה ברמה subcellular. נכון לעכשיו, רוב ננו-רפואת הסרטן עדיין נכשלים עצם בניסויים קליניים עקב הפרמקוקינטיקה הכי המוצלחת שלהם, biodistributions, ופרופילים רעילים. מצד השני, ההטרוגניות הגדולה של תגובה לטיפול כדי nanomedicine מחייבת אסטרטגית הדמית לוויה לבחירת מטופלים שעשויים להועיל במיוחד ננו-רפואה אלה הניסיונות. אנו מאמינים כי אימוץ הליך זה יכול לעזור לקהילה לזהות ננו-רפואה מבטיחה עם פוטנציאל translational גבוה במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים, עם השינוי אלא יוכל גם לעזור קליניהחוקרים לזהות חולים מקובל nanotherapy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPPC Avantilipids 850355
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
DSPE-PEG2000 Avantilipids 880120P
DSPE-DFO Home made 110634 Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DS AAT Bioquest 22051
Centrifugal filter Vivaproducts VS2061
Rotary evaporator Buchi R-100
Radio-HPLC Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps N/A
89Zr-oxalate MSKCC Synthesized in house TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.)
Micro PET-CT Siemens Inveon Micro-PET/CT
Gamma counter PerkinElmer 2470-0150
Flow cytometry BD Biosciences Fortessa Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice
C57BL/6 mice Jackson Laboratories
B16-YFP melanoma cells Home made N/A Salmon et al., Immunity, 2016
Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7 128025 Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC 107613 Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510 103137 Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7 139313 Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605 101237 Biolegend
CD3 (17A2)--BV711 100241 Biolegend
CD31 (13.3)--PE 561073 Biolegend
CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5 117327 BD Biosciences
CD31 (13.3) no fluorophore 550274 BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
  2. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control Release. 160, 117-134 (2012).
  3. Green, M. R., et al. Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).
  4. Juliano, R. Nanomedicine: is the wave cresting? Nat Rev Drug Discov. 12, 171-172 (2013).
  5. Ledford, H. Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs. Nature. 533, 304-305 (2016).
  6. Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs! Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).
  7. Dunphy, M. P., Lewis, J. S. Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET. J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).
  8. Perez-Medina, C., et al. PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).
  9. Perez-Medina, C., et al. A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting. J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).
  10. Perez-Medina, C., et al. Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy. Nature communications. , (2016).
  11. Tang, J., et al. Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation. Science advances. , (2015).
  12. Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).
  13. Gianella, A., et al. Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer. ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).
  14. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).
  15. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, 924-938 (2016).
  16. Perez-Medina, C., et al. In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models. JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).
  17. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature communications. 5, 3065 (2014).
  18. Carney, B., et al. Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models. Mol Imaging Biol. , (2015).
  19. Salinas, B., et al. Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging. EJNMMI Res. 5, 123 (2015).
  20. Carlucci, G., et al. Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma. Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).
  21. Tang, J., et al. Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).
  22. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nat Rev Cancer. 12, 278-287 (2012).
  23. Goodwill, P., et al. X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging. Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).

Tags

Cancer Research גיליון 121 ננו-רפואה PET radiolabeling cytometry זרימה liposome הדמיה מולקולרית מלנומה במודלים של עכברים עם מערכת חיסון תקינה
נוהל מקיף כדי להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; ביצועים של סרטן ננו-רפואה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, J., Pérez-Medina, C.,… More

Tang, J., Pérez-Medina, C., Zhao, Y., Sadique, A., Mulder, W. J. M., Reiner, T. A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines. J. Vis. Exp. (121), e55271, doi:10.3791/55271 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter