タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定
Summary
植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。
Abstract
原形質 (Pd) は、小規模および大規模な分子は植物細胞間輸送されるゲートウェイとして機能する細胞間の接続です。生体高分子、このようなタンパク質の細胞間輸送がほとんどの特定ターゲット信号を含むアクティブなメカニズムを介して発生しますイオンと水などの小分子の Pd トランスポートは、受動的に発生すると推定されているに対し、分子を輸送しました。識別された原形質 (Pd) のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の希少性蛋白質の並べ替えについて厳しく制限している経路に関与する植物細胞間高分子輸送と通信します。植物の富から Pd は、通過するトラフィックに知られている内因性やウイルスの蛋白質のみ 3 PLSs 報告されているまでに、内因性の植物タンパク質からそれらのすべて。したがって、それは、必要かつ十分な生活の中で直接、Pd のターゲット機能 PLS のシーケンスを識別するために信頼性の高いかつ体系的な実験的戦略を策定する重要な植物細胞。ここでは、私たちはパラダイムとしてタバコ モザイク ウイルス(TMV) の細胞間移行タンパク質 (MP) を使用して 1 つのような戦略をについて説明します。これらの実験は、識別され、最初の特徴は、植物の PLS のウイルス、最も Pd ターゲット蛋白質の PLS シーケンスの発見のために適応することができます。
Introduction
原形質 (Pd) は、植物の成長と形態形成、転写因子 mRNA と小さな RNA 分子に至るまでの主調整装置の細胞間輸送のための導管として機能します。さらに、Pd のこの高分子輸送能力を用いてほとんどの植物ウイルスの細胞間伝播感染;具体的に Pd1,2,3,4,5,6にターゲット移行タンパク質 (Mp) と呼ばれる特殊な蛋白質を進化してきた植物ウイルス Pd を通過するには,7. Pd 輸送の分子経路が最も可能性の高いこれらの経路に運ばれたタンパク質を対象とする特定のシーケンスと密接に相互接続されました。したがって、これらの Pd のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の識別は、対応する Pd 輸送経路の診断可能性があります。これは Pd 輸送8、類推によって異なる核輸入道に、異なる核局在化信号 (NLS) シーケンス9,10のために特定することができますたとえば。概念的には、NLSs と PLSs は、必要かつ十分な対象は、非分解の細胞内ターゲット シーケンスを表します。ただし、NLSs11とは異なり、シーケンスについては、PLSs は厳しく制限されています。具体的には、Pd をターゲットに関与する唯一の 4 つのタンパク質配列は、内因性の植物タンパク質から派生したそれらのすべての報告されています。最初の 1 つは、KN112 -内側の細胞層から植物葉13の表皮に移動する転写因子-そのノックス同族体14のホメオ ドメインによって表されます。また、2 つ目は、モチーフ15を転写因子、Dof、これは細胞間人身売買 (IT) として記載されている推定 PLS が含まれているからです。3 番目のシーケンス PDLP1 1 原形質常駐型膜タンパク質から、膜貫通ドメイン16によって表されます。最後に、シーケンスをターゲット 4 Pd の一種 (GPI) の報告された最近の固定された蛋白質、それは一種 (GPI) 変更信号17で表されます。
興味深いことに、ごく最近まで PLSs が報告されていないウイルスの MPs のため。以前の研究に植物ウイルス MPs18,19、すなわち、必要と Pd を無関係な貨物分子 (ターゲットに十分な最小限のアミノ酸配列などない真 PLS で推定 PLS シーケンスの存在が示されています。例えば。、CFP) ウイルスの MP で確認されました。まだこれらの蛋白質は、タバコ モザイク ウイルス(TMV) の MP の Pd の局在と輸送が実証20されている最初でした。
このギャップに対処する私たちは TMV MP PLS を識別する実験的戦略を開発しました。この戦略は、3 つの概念に基づいていた。(i) 我々 は必要かつ Pd21に標的蛋白質の十分な最小限アミノ酸として PLS を定義しました。(ii) ため、TMV MP をまず Pd をターゲットからこれらのチャンネル22移行し、これらの 2 つのアクティビティの連結を解くことと、善意の PLS は、Pd がターゲットだけとないため以降のトランスポート機能を識別するを目指した。(iii) は、Pd かどうか、構造的または機能的活動をターゲットに重要なアミノ酸残基の同定された PLS を分析しました。このアプローチを使用すると、我々 を善意の PLS として TMV MP のアミノ末端の 50 アミノ酸残基のシーケンスで区切られました。これは蛋白質の全体の長さを飽和 TMV MP フラグメントのシリーズを生産、CFP と彼らのカルボキシル末端のタグ付け、一過性植物組織でそれらを表現することによって行われました。各テストのフラグメントの Pd ローカリゼーションは、Pd マーカー蛋白質、PDCB1 (Pd カロース結合蛋白質 1)23でそれらを coexpressing によって決定されました。まだ pd、ローカライズが Pd を通過した最小フラグメントは、PLS を表すと考えられていた。最後に、PLS は、その構造や機能に必要な重要なアミノ酸残基を決定するアラニン スキャンでした。
ここで TMV MP PLS の同定を記述することによってこのアプローチを説明、一方それ使用されるかもしれない他の Pd 対象のタンパク質で PLSs を発見する植物病原菌、植物自体をエンコードするかどうかこれは本手法は Pd にターゲットする能力に関してウイルス MPs の固有の機能の利点を取らないので。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは 4 つのコア成分: が必要であり、Pd、興味の蛋白質のフラグメントの長さは、徐々 に小さく分割体系的なテストの融合へ十分なシーケンスを識別する概念フラグメントとしても役立つタグとして高分子貨物と Pd が生活の中でターゲット機能試金される蛋白質を植物の次のテストの融合タンパク質の一過性発現組織。一過性発現のアグロバクテリウム仲介されたがの時間、…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
スペースの不足は、我々 はほとんどレビュー記事を引用し、その元作品が引用された私たちの同僚に申し訳。仮想研究所の仕事は、仮想に BSF、バード、米国農務省/NIFA NSF NIH からの補助金によってサポートされ、S.G.L. 研究所 NIH と S.G.L. に植物微生物学植物病理学の部門からの資金でサポートされて
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
References
- Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
- Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
- Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
- Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
- Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
- Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
- Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
- Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
- Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
- Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
- Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
- Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
- Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
- Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
- Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
- Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
- Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
- Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
- Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
- Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
- Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
- Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
- Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
- Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
- Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
- Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
- Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
- Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
- Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
- Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
- Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).
