JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Published: August 15, 2017
doi:
10.3791/55301
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology,Cornell University

Summary

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) ağ geçitleri üzerinden bitki hücreleri arasında küçük ve büyük moleküllerin taşınmaktadır olarak işlev hücre hücre bağlantılardır. PD taşıma ile küçük moleküllerin, iyonlar ve su, pasif gerçekleşmesi için kabul edilir ise, biyolojik oluştururlar, böyle proteinler, hücre hücre aktarımı büyük olasılıkla belirli hedefleme sinyalleri içerir etkin bir mekanizma yoluyla oluşur molekül nakletti. Tanımlanan plasmodesmata (Pd) yerelleştirme sinyalleri (PLSs) kıtlığı ciddi protein sıralama anlayış kısıtladı yollar dahil bitki hücre hücre makromoleküllerin ulaşım ve iletişim. Bitki zenginliği endojen ve viral proteinler Pd, trafikten bilinen sadece üç PLSs bildirilmiştir bugüne kadar hepsi endojen bitki proteinleri. Böylece, gerekli ve Pd hedefleme, doğrudan yaşam için yeterli olan fonksiyonel bir PLS sırasını, tanımlamak için güvenilir ve sistematik deneysel bir strateji geliştirmek önemlidir bitki hücreleri. Burada, biz bir paradigma olarak Tütün mozaik virüsü (TMV) hücre hücre hareketi protein (MP) kullanarak böyle bir strateji tanımlarlar. Bu deneyler, tespit ve ilk karakterize viral PLS dikmek, en Pd hedeflenmiş proteinler serilerinde PLS keşfi için adapte edilebilir.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) anahtar düzenleyiciler bitki gelişme ve mRNA ve küçük RNA molekülleri transkripsiyon faktörleri kadar morfogenez, hücreler arası taşıma için kanalların görevi. Ayrıca, polis bu makromoleküllerin taşıma kapasitesi onların hücreler arası forma için çoğu bitki virüsler tarafından enfeksiyon sırasında kullanılmaktadır; PD taşımak için bitki virüs hareketi proteinler (MPs), özellikle Pd1,2,3,4,5,6 için hedef olarak adlandırdığı özel proteinler geliştiğini , 7. Pd taşıma moleküler yollar büyük olasılıkla bu yolları taşınan proteinler hedef belirli serileri ile yakından bağlantılı. Böylece, bu Pd yerelleştirme sinyaller (PLSs) tanımlaması karşılık gelen Pd taşıma yolu tanı olabilir. Örneğin, farklı nükleer yerelleştirme sinyal (NLS) dizileri9,10için belirli olabilir farklı nükleer alma yolları için Pd taşıma8, kıyasen olacaktır. Kavramsal olarak, NLSs ve PLSs gerekli ve yeterli hedefleme için yarilabilir hücre altı hedefleme sıraları temsil eder. Ancak, NLSs11farklı olarak, PLSs sıra vukuf ciddi sınırlıdır. Özellikle, sadece dört protein sequences Pd hedefleme dahil, hepsiyle endojen bitki proteinleri türetilmiş bildirilmiştir. İlki KN112 -iç hücre katmanlardan bitki yaprak13 epidermis için hamle bir transkripsiyon faktörü-ve onun KNOX homologs14homeobox etki alanı tarafından temsil edilir. İkincisi de bir transkripsiyon faktörü, hücreler arası (BT) ticareti olarak açıklanan bir sözde PLS içerir Dof motifi15uzaklıktadır. PDLP1 plasmodesmata yerleşik tip 1 membran protein üçüncü dizisidir ve bir transmembran etki alanı16tarafından temsil edilir. Son olarak, sıra hedefleme dördüncü Pd son zamanlarda glycosylphosphatidylinositol (GPI) rapor edilmiştir-bağlantılı protein ve glycosylphosphatidylinositol (GPI) değişiklik sinyali17tarafından temsil edilir.

İlginçtir, çok yakın zamana kadar hiçbir PLSs bildirilmiştir için viral MPs. Önceki çalışmalarda sözde PLS serilerinde bitki viral MPs18,19ama hiçbir gerçek PLS Yani, gerekli ve yeterli Pd bir ilişkisiz kargo molekül () hedefleme için en az amino asit dizisi varlığı belirtilen örn., CFP) viral bir MP olduğu belirlendi. Henüz bu proteinler, Tütün mozaik virüsü (TMV), MP için hangi Pd Yerelleştirme ve taşıma gösterdiği20olmuştur ilk biriydi.

Bu boşluğu adrese TMV MP PLS tanımlamak için deneysel bir stratejisi geliştirdi. Bu strateji üç kavramlar üzerine dayanıyordu. (i) biz PLS gerekli ve yeterli protein Pd21‘ e hedefleme için en az amino asit dizisi olarak tanımlanır. (ii) çünkü TMV MP Öncelikle Pd hedefleyen ve bu kanalları22translocates, biz bu iki etkinlikler uncoupling ve iyi niyetli PLS, hangi görev sonraki taşıma için değil de yalnızca Pd hedefleme için tanımlama amaçlı. (iii) biz etkinlik, yapısal veya fonksiyonel olarak hedefleme onun Pd amino asit kalıntıları eklenmesi önemli için tanımlanan PLS analiz edildi. Bu yaklaşımı kullanarak, bir 50-amino asit kalıntı sıra amino-terminus iyi niyetli PLS davranır TMV MP, belirlendi. Bu protein tüm uzunluğu doymuş TMV MP parçaları bir dizi üreten, onların karboksil termini CFP ile etiketleme ve geçici onları bitki dokularda ifade tarafından yapıldı. PD yerelleştirme her test parçaları bir Pd marker protein, PDCB1 (Pd callose bağlayıcı protein 1)23coexpressing tarafından tespit edilmiştir. PLS temsil etmek için hala merkeze lokalize ama polisi, dizinlere değil en küçük parçası olarak kabul edildi. Son olarak, PLS alanin onun yapısı ve/veya işlev için gerekli anahtar amino asit kalıntıları belirlemek için taranan.

Oysa burada TMV MP PLS tanımlaması açıklayarak bu yaklaşım göstermek, o herhangi bir diğer Pd hedeflenmiş proteinler arasında PLSs keşfetmek için bitki patojenleri veya bitkiler kendileri ile kodlanmış olup olmadığını istihdam edilebilir; Bunun nedeni bizim yöntem viral MPs onların yetenek-e doğru hedef açısından herhangi bir benzersiz özelliklerinin avantajlarından merkeze almaz.

Protocol

1. bitki materyali Bitki türlerinin seçimi Faiz, Yani, hangi endojen proteinler için bu protein kodlar ya da patojen viral proteinler için doğal konağını temsil eden bir protein için yerli bitki türü kullanın. Buna ek olarak, seçilen bitki türleri için geçici genetik dönüşüm yöntemi seçilen mükellef olması gerekir.Not: Çalışmalar düzenli olarak TMV için iyi bir ev sahibi gösteren ve verimli bir şekilde genetik dönüşümü Agrobacterium aracılı tekniği, …

Representative Results

Sadakatle açıklanan kurallarından beklenen sonuçlar göstermek ve TMV MP PLS tanımlamak, temsilcisi verileri Yuan ve ark. adapte olmuşlardır 21. şekil 1A ilk özetleyen önemli yapılar tam uzunlukta TMV MP (1-268), TMV MP PLS (oluşan ilk 50 amino asit kalıntıları protein 1-50), ifade ve onun alanin V4A türevleri tarama erimiş (olarak üretilen CFP için açıklanan adımları 2.2, 5.2 ve 6) şekil 1B özetle…

Discussion

Bu iletişim kuralının dört çekirdek bileşenlerinin vardır: gerekli ve yeterli test eritme merkeze sistematik lige uzunluğu, giderek azalır parçaları ilgi proteinin hedefleme için bir dizi tanımlama kavramı Hem etiketi hem makromoleküllerin kargo ve Pd yaşayan hedefleme için fonksiyonel tahlil olarak hizmet veren bir autofluorescent protein parçaları test füzyon proteinlerin geçici ifade aşağıdaki dokular bitki. Not geçici ifade Agrobacterium aracılı zaman, Yani, birkaç gün, sık sık…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yeterli yer olmaması, çoğunlukla gözden makaleler gösterdi ve meslektaşlarımıza orijinal eserleri değil gösterildi özür dileriz. V.C. laboratuvar çalışmalarında V.C. NIH, NSF, USDA/NIFA, Ozan ve BSF hibe tarafından desteklenmektedir ve S.G.L. laboratuvar NIH ve bitki patoloji bölümleri ve bitki-mikrop Biyoloji fonlarından için S.G.L. tarafından desteklenmektedir

Materials

Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Tags

Keywords: PlasmodesmataLocalization SignalIntercellular TransportProtein TargetingNicotiana BenthamianaFluorescent TaggingAgrobacterium TumefaciensTransient Expression
check_url/fr/55301?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image