Plasmodesmal 지역화 시퀀스 Planta에 단백질의 식별
Summary
식물 세포 연결을 plasmodesmata (Pd), 역할 중앙 식물 생리학, 식물 바이러스 상호 작용. Pd 교통 위험은 신호 단백질 경찰을 직접 분류 하 고 있다. 그러나, 이러한 시퀀스에 대 한 우리의 지식을 초기 단계에서 아직도 이다. 우리는 Pd 대상 단백질에 Pd 지역화 신호를 식별 하는 전략을 설명 합니다.
Abstract
Plasmodesmata (Pd)는 셀 연결 게이트웨이 통해 크고 작은 분자는 식물 세포 사이 수송으로 작동. 생물 고분자, 그러한 단백질의 셀 전송에 특정 대상 신호를 포함 하는 활성 메커니즘을 통해 대부분 발생 Pd 전송 작은 분자, 이온과 물, 등의 수 동적으로 발생 추정, 반면에 분자를 수송. 식별된 plasmodesmata (Pd) 지역화 신호 (PLSs)의 부족은 심각 하 게 단백질 분류의 이해 제한 경로에 관련 된 식물 셀 고분자 전송 및 통신. 다양 한 식물에서에서 Pd 통해 트래픽을 알려진 내 인 성 및 바이러스 성 단백질 3 PLSs 보고 되었습니다 데이트, 내 생 식물 단백질에서 그들의 모든. 따라서, 그것은 필요 하 고 생활에 직접 Pd 대상에 대 한 충분 한 기능 PLS 시퀀스를 식별 하는 안정적이 고 체계적인 실험 전략을 개발 하는 중요 한 식물 세포. 여기, 우리가 같은 전략 패러다임으로 담배 모자이크 바이러스 (TMV)의 셀 운동 단백질 (MP)를 사용 설명. 이러한 실험을 확인 하 고 첫 번째 특징 식물 바이러스 PLS, PLS 시퀀스 가장 Pd 대상 단백질의 발견에 대 한 적용할 수 있습니다.
Introduction
Plasmodesmata (Pd) 식물 개발 및 녹음 방송 요인에서 mRNA와 작은 RNA 분자에 이르기까지 morphogenesis의 키 레 귤 레이 터의 세포 수송을 위한 도관으로 작동 합니다. 또한,이 고분자 전송 용량 Pd의 활용 그들의 세포 확산에 대 한 대부분의 식물 바이러스에 의해 감염; 시 Pd를 통해 이동, 식물 바이러스 이동 단백질 (MPs), 특히 Pd1,2,3,4,,56 대상 되 나 특수 단백질 진화 , 7. Pd 전송의 분자 경로 대부분 이러한 경로에 수송된 단백질을 대상으로 특정 시퀀스와 밀접 하 게 상호는. 따라서, 이러한 Pd 지역화 신호 (PLSs)의 진단 해당 Pd 전송 통로의 있을 수 있습니다. 이것은 Pd 전송8, 비유 하 여 예를 들어 다른 핵 지 방화 신호 (NLS) 시퀀스9,10에 대 한 특정 될 수 있는 다른 핵 가져오기 경로. 개념적으로, NLSs와 PLSs 비 쪼갤 subcellular 타겟팅은 시퀀스를 필요 하 고 대상에 대 한 충분 한을 나타냅니다. 그러나, NLSs11, 달리 PLSs에 대 한 시퀀스 정보 심각 하 게 제한 됩니다. 특히, 단지 4 개의 단백질 시퀀스 Pd 대상에 관련 된 보고 되었습니다, 내 생 식물 단백질에서 파생 된 그들의 모든. 첫 번째 KN112 –13 의 식물 잎 표 피 안쪽 세포 층에서 이동 하는 녹음 방송 요인-와 그것의 녹 스 homologs14의 homeobox 도메인으로 표시 됩니다. 또한 두 번째 주제15전사 요소, Dof, 세포 매매 (그것)으로 상 상속 PLS를 포함에서입니다. 세 번째 순서 PDLP1 plasmodesmata 거주 유형 1 막 단백질에서 이며 막 횡단 도메인16로 표현 됩니다. 마지막으로, 네 번째 Pd 시퀀스를 대상으로 최근에 알려졌다 glycosylphosphatidylinositol (GPI)에 대 한-고정 된 단백질과 그것 glycosylphosphatidylinositol (GPI) 수정 신호17로 표시 됩니다.
흥미롭게도, 아주 최근까지, 아무 PLSs 바이러스 MPs에 대 한 보고 되었습니다. 이전 연구에서 식물 바이러스 MPs18,19, 하지만 아무 진정한 PLS, 즉, 최소한의 아미노산 시퀀스 필요 하 고 Pd 없는 화물 분자 (대상에 대 한 충분 한 상 상속 PLS 시퀀스의 존재 표시 예., CFP) 바이러스 MP에서 발견 되었습니다. 그러나이 단백질, 담배 모자이크 바이러스 (TMV), MP 중 하나는 Pd에 대 한 지역화 및 전송 되었습니다 시연된20하는 첫번째 이었다.
이 차이 해결 하기 위해 우리는 TMV MP PLS를 식별 하는 실험적인 전략을 개발 했다. 이 전략은 세 가지 개념을 기반으로 합니다. (i) 정의 PLS 최소한의 아미노산 시퀀스를 필요 하 고 Pd21대상 단백질에 대 한 충분 한로. (ii) 때문에 TMV MP Pd를 대상으로 먼저 하 고 다음 이러한 채널22를 통해 translocates, 우리는 이러한 두 활동을 분리 시에 타고 난 PLS, Pd를 대상으로, 대만 그리고 후속 전송 함수를 식별 목적. (iii) 우리는 구조적 또는 기능적 활동을 대상으로 하는 Pd에 대 한 중요 한 아미노산 잔류물에 대 한 확인 된 PLS를 분석. 이 방법을 사용 하 여, 우리에 아미노-타고 난 PLS 역할 TMV MP의 50-아미노 산 성 잔류물 시퀀스 구분 된. 이것은 단백질의 전체 길이 포화 TMV MP 파편의 시리즈를 생산, 그들의 carboxyl-테르미니 CFP와 태그와 뚜렷이 식물 조직에서 그들을 표현 하 여 이루어졌다. Pd 지역화 테스트 조각의 각 Pd 마커 단백질, PDCB1 (Pd callose 의무적인 단백질 1)23로 그들을 coexpressing에 의해 결정 되었다. 여전히 Pd로 하지만 Pd, 통과 하지 않았다 작은 조각 PLS를 표현 하기 위해 고려 되었다. 마지막으로,는 PLS 주요 아미노산 잔류물의 구조 또는 기능에 필요한 확인 하려면 알라닌 스캔 했다.
반면 여기 우리는 TMV MP PLS의 식별을 설명 하 여이 방법을 설명 하기 위해, 그것은 식물 병원 균에 의해 또는 스스로; 식물에 의해 인코딩 여부에 어떤 다른 Pd 대상 단백질에 PLSs를 채택 수 있습니다. 이 때문에 우리의 방법 Pd를 대상으로 그들의 능력에 관해서는 바이러스 MPs의 모든 고유 기능을 고려 하지 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 4 명의 코어 성분: 시퀀스를 필요 하 고 충분 한 Pd, 길이, 점차적으로 줄어드는 조각으로 관심사의 단백질의 체계적인 부문 융합는 테스트 대상에 대 한 식별의 개념 태그와 고분자 화물, 및 Pd 생활에 대상에 대 한 기능 분석 결과 제공 하는 autofluorescent 단백질 조각 공장 테스트 융해 단백질의 과도 식 다음 조직. Note Agrobacterium 중재 과도 식 시간, 즉, 몇 일, 유사한 연구<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
공간 부족에 대 한 우리 대부분 검토 기사를 인용 하 고 우리는 그의 원래 일 인용 하지 되었다 우리의 동료에 게 사과. V.C. 실험실에서 작업을 V.C., NIH, NSF, USDA/NIFA, 시인, 그리고 BSF에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. 그리고 S.G.L. 실험실 NIH와 S.G.L.에 부서의 식물 병리학과 식물-미생물 생물학에서 자금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
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