Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta
Summary
Connessioni intercellulari di pianta, la Plasmodesmi (Pd), giocano un ruolo centrale nella pianta interazioni pianta-virus e di fisiologia. Critica ai trasporti Pd sono smistamento segnali che indirizzano proteine al Pd. Tuttavia, la nostra conoscenza di queste sequenze è ancora nella sua infanzia. Descriviamo una strategia per identificare i segnali di localizzazione di Pd in proteine Pd-mirati.
Abstract
I Plasmodesmi (Pd) sono connessioni cellula–cellula che fungono da gateway attraverso cui piccole e grandi molecole sono trasportate tra cellule vegetali. Considerando che il trasporto del Pd di piccole molecole, quali gli ioni ed acqua, è presunta per accadere passivamente, cellula–cellula trasporto di macromolecole biologiche, tali proteine, si verifica molto probabilmente attraverso un meccanismo attivo che coinvolge specifici segnali di targeting sul trasportato della molecola. La scarsità di segnali di localizzazione identificati i Plasmodesmi (Pd) (PLSs) ha limitato severamente la comprensione della proteina-ordinamento pathways coinvolti nella pianta cellula–cellula macromolecolari trasporti e comunicazioni. Da una ricchezza di pianta proteine endogene e virale conosciute al traffico attraverso Pd, PLSs solo tre sono stati segnalati fin qui, tutti loro da proteine vegetali endogeni. Quindi, è importante sviluppare una strategia sperimentale sistematica e affidabile per identificare una sequenza PLS funzionale, che è necessario e sufficiente per il Pd targeting, direttamente nel soggiorno cellule vegetali. Qui, descriviamo una tale strategia utilizzando come paradigma della proteina della cellula–cellula movimento (MP) del virus del mosaico del tabacco (TMV). Questi esperimenti, che identificato e caratterizzato il primo impianto PLS virale, può essere adattati per l’individuazione di sequenze PLS in proteine più Pd-mirati.
Introduction
I Plasmodesmi (Pd) funzionano come condotti per trasporto intercellulare di regolatori chiave di sviluppo di pianta e morfogenesi, che vanno da fattori di trascrizione di mRNA e piccole molecole di RNA. Inoltre, questa capacità di trasporto macromolecolare del Pd è utilizzata dalla maggior parte dei virus vegetali per la loro diffusione intercellulare durante l’infezione; per spostarsi tra Pd, virus vegetali si sono evolute proteine specializzate, chiamate proteine di movimento (MPs), che si rivolgono specificamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vie molecolari di trasporto Pd molto probabilmente sono intimamente interconnesse con le sequenze specifiche che mirano le proteine trasportate in queste vie. Così, identificazione di questi segnali di localizzazione di Pd (PLSs) può essere diagnostica del pathway di trasporto corrispondente di Pd. Questo è per analogia di Pd trasporto8, ad esempio, alle vie di importazione nucleare differenti, che possono essere specifiche per differenti localizzazione nucleare (NLS) di segnale sequenze9,10. Concettualmente, sia NLSs e PLSs rappresentare non liberabili sequenze di targeting subcellulare che sono necessarie e sufficienti per il targeting. Tuttavia, a differenza di NLSs11, le informazioni di sequenza PLSs sono severamente limitate. In particolare, sono state segnalate solo quattro sequenze di proteine coinvolte nel Pd targeting, con tutti i loro derivati da proteine vegetali endogeni. Il primo è rappresentato da un dominio homeobox di KN112 – un fattore di trascrizione che si muove da strati di cellule interne all’epidermide della pianta foglia13 – e i suoi omologhi di KNOX14. Quello secondo è anche da un fattore di trascrizione, Dof, che contiene un putativo PLS descritto come la tratta intercellulare (IT) motivo15. La terza sequenza è dalla proteina della membrana i plasmodesmi residente tipo 1 PDLP1, ed è rappresentato da un dominio transmembrana16. Infine, il quarto Pd sequenza di targeting recentemente è stato segnalato per glicosilfosfatidilinositolo (GPI)-proteine ancorate ed esso è rappresentato dal segnale di modificazione glicosilfosfatidilinositolo (GPI)17.
È interessante notare che, fino a poco tempo fa, nessun PLSs sono stati segnalati per MPs virale. Gli studi precedenti hanno indicato la presenza di presunti PLS sequenze in pianta virale MPs18,19, ma nessun vero PLS, vale a dire, una sequenza di amminoacido minimo necessaria e sufficiente per il Pd targeting di un carico indipendenti molecola ( ad es., PCP) è stata identificata in un MP virali. Ancora una di queste proteine, MP del virus del mosaico del tabacco (TMV), era il primo per cui Pd localizzazione e trasporti sono stati dimostrati20.
Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato una strategia sperimentale per identificare TMV MP PLS. Questa strategia si basa su tre concetti. (i) abbiamo definito PLS come una sequenza di amminoacido minimo che è necessario e sufficiente per il targeting di proteina a Pd21. (ii) perché TMV MP in primo luogo destinato a Pd e poi trasloca attraverso questi canali22, abbiamo mirato a disgiungere queste due attività e identificare il PLS buona fede, che funziona solo per il targeting del Pd e non per il successivo trasporto. (iii) abbiamo analizzato il PLS identificato per residui dell’aminoacido importante per suo Pd targeting attività, sia strutturalmente che funzionalmente. Utilizzando questo approccio, abbiamo delineato una sequenza di 50-ammino acido residuo dell’estremità amminica di TMV MP che funge da PLS buona fede. Questo è stato fatto da producendo una serie di frammenti di TMV MP che satura l’intera lunghezza della proteina, tagging loro carbossilico-termini con PCP e transitoriamente esprimerli nei tessuti vegetali. Localizzazione del PD di ciascuno dei frammenti testati è stato determinato che li coexpressing con una proteina marker Pd, PDCB1 (Pd callosio proteina obbligatoria 1)23. Il frammento più piccolo che ancora localizzato al Pd, ma non ha fatto attraversare il Pd, è stato considerato per rappresentare PLS. Infine, il PLS era alanina-analizzati per determinare i residui dell’aminoacido chiave necessari per la sua struttura e/o funzione.
Considerando che qui illustriamo questo approccio descrivendo identificazione di TMV MP PLS, può essere impiegato per scoprire PLSs in qualsiasi altre proteine Pd-mirati, se codificato da patogeni vegetali o da impianti stessi; Questo è perché il nostro metodo non approfittare di eventuali caratteristiche uniche di MPs virale per quanto riguarda la loro capacità di destinazione al Pd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo ha quattro componenti principali: il concetto di identificazione di una sequenza che è necessario e sufficiente per il targeting al Pd, divisione sistematica della proteina di interesse in frammenti che sono progressivamente ridotti in lunghezza, fondendo il collaudato frammenti di una proteina di autofluorescent che serve sia come tag e come cargo macromolecolare e analisi funzionale per il Pd targeting in vita pianta tessuti dopo l’espressione transitoria delle proteine di fusione testata. Si noti ch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Per la mancanza di spazio, abbiamo citato principalmente articoli di recensione e ci scusiamo con i nostri colleghi cui lavoro originale non è stato citato. Il lavoro in laboratorio V.C. è supportato da sovvenzioni dal NIH, NSF, USDA/catino, BARD e BSF a V.C., e il laboratorio S.G.L è supportato da NIH e fondi dai dipartimenti di patologia vegetale e biologia vegetale-microbo a S.G.L
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
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