Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.
Abstract
Asymmetrisch modifizierte Nukleosomen enthalten die beiden Kopien eines Histon (Schwester Histone) dekoriert mit unterschiedlichen Mengen von Post-translationale Modifikationen (PTM). Sie sind neu Spezies mit unbekannten Mitteln Niederlassungs- und funktionelle Auswirkungen identifiziert. Aktuelle analytische Methoden sind unzureichend, um die Kopie spezifische Auftreten von PTM auf die nukleosomalen Schwester Histone zu erkennen. Dieses Protokoll stellt ein biochemisches Verfahren zur in vitro Rekonstitution von Nukleosomen differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Der erzeugte Komplex kann auch asymmetrisch modifiziert werden, nachdem ein vormodifizierter Histon-Pool auch während der Histon Subkomplexe Neufaltung. Diese asymmetrischen Nukleosom Zubereitungen können leicht umgesetzt werden, mit Histon-modifizierende Enzyme Modifikation Übersprechens Mechanismen durch die asymmetrisch vorge eingebaut PTM unter Verwendung der kernmagnetischen Resonanz (NMR) -Spektroskopie auferlegt zu studieren. Insbesondere sind die Modifizierungsreaktionen inEchtzeit kann durch die Durchführung verschiedener Arten von NMR-Korrelationsexperimente, zugeschnitten für das jeweilige Isotop Typ unabhängig von den beiden Schwester Histone abgebildet werden. Diese Methode liefert die Mittel Übersprechmechanismen zu untersuchen, die zur Bildung und Ausbreitung von asymmetrischen PTM Muster auf nukleosomalen Komplexe beitragen.
Introduction
Eukaryotische DNA ist eng in die Zellkerne in Chromatin verpackt. Der grundlegende Baustein des Chromatins ist die Nukleosomen Kernteilchen, die ~ 147 bp DNA um einen oktameren Komplex, bestehend aus zwei Kopien jeder der vier Core-Histone (H3, H4, H2A, H2B) gewickelt enthält. Histon-Proteine beherbergen eine Vielzahl von Post-translationale Modifikationen (PTM). Diese kovalente Substitutionen induzieren Veränderungen in der Chromatinstruktur, sowohl direkt durch die physikalische Chemie des Systems zu beeinflussen und indirekt durch die Einstellung von Chromatin-Remodeling – Aktivitäten 1, 2, 3. Durch diese Mittel steuern Histon PTMs Chromatin Zugänglichkeit und damit regeln alle DNA-basierten zellulären Funktionen 4.
PTM werden von Histon-modifizierenden Enzymsysteme vor allem auf die unstrukturierte N-terminalen Segmente (Schwänze) von Nukleosomen-Kern integriert histo installiertang. Aufgrund der vielen Modifikationsstellen auf der relativ kurzen Sequenz von Histon – tails beeinflussen PTMs einander durch Induzieren oder nachfolgenden Modifikationsreaktionen zu blockieren, eine Wirkung als Modifikationsübersprechens 5 bekannt. Aufgrund der insgesamt symmetrischen Architektur der Nukleosomen, Modifikationsreaktionen und Übersprechmechanismen wurden gedacht, um in ähnlicher Weise auf die zwei Kopien von jedem nukleosomalen Histon (Schwester Histone) auftreten. Dieses Konzept wurde vor kurzem in Frage gestellt und später widerlegt. Insbesondere zeigten in vitro enzymatische Tests auf freien Histon H3 Schwanz Peptide und auf Nukleosomen , dass eine Reihe von H3 – Kinasen 6 – Phosphorylierung in asymmetrischer Weise eingeführt. Zusätzlich Affinitätsreinigung basierten LC-MS / MS – Analyse zeigte das Vorhandensein von unsymmetrisch H3-methylierten Nukleosomen in verschiedene Arten von eukaryotischen Zellen 7. Somit bilden asymmetrisch modifizierten Nukleosomen neuartige Arten undWerkzeuge nötig sind, um die Mechanismen aufzudecken, die ihre Bildung steuern und die Übersprecheffekte zu analysieren, dass diese Asymmetrie ausüben könnten.
Üblicherweise wurden Western Blot (WB) und Massenspektrometrie (MS) -Analyse verwendet Histon PTMs zu detektieren. Trotz seiner einfachen Anwendung, leidet WB aus Spezifität / Kreuzreaktivität Probleme. Hinzu kommt, dass ist es nicht in der Lage 8 simultane Multi-PTM Analyse und direkte Quantifizierung der Modifikationsreaktionen durchzuführen. Auf der anderen Seite beschäftigt MS – Analyse ausgefeilte Instrumentierung , die Ausbildung auf hohem Niveau erfordert, bietet aber eine hohe Spezifität sowie gleichzeitige Kartierung und Quantifizierung von mehreren PTM 9. Jedoch sind beide Verfahren disruptive und die nukleosomalen Komplexe vor der Analyse dissoziiert, zu einer Mischung von Histonen und / oder Histon abgeleiteten Peptiden führt. Diese Manipulation entfernt die Möglichkeit, unabhängig zu unterscheidenModifikationsreaktionen, die auf jeder der beiden Schwester Histone auftreten und die Kopie spezifischen Modifikation Status der nukleosomalen Histone zu melden.
Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie als alternative Methode entwickelt PTM Reaktionen zuzuordnen. NMR ist eine unterbrechungsfreie und ermöglicht so die Kontrolle der PTM Ereignisse in einer Echtzeit – Weise in rekonstituierten Mischungen und sogar in intakten Zellen 10, 11. Die Entwicklung von Routinen zur schnellen Datenerfassung sowie für hochauflösende Abbildung basierend auf 2D heteronuklearen Korrelationsverfahren von isotopenmarkierten (15 N und / oder 13 C) Proben 12 erlaubt die gleichzeitige Abbildung von verschiedenen Arten von PTMs, beispiels als Serin / Threonin / Tyrosin – Phosphorylierung, Acetylierung Lysin / Methylierung und Arginin Methylierungs 13. In Abhängigkeit von der PTM untersuchten 15 N- oder 13 C-Kennzeichnung protocols kann das Protein funktionelle Gruppe zu markieren, die verwendet werden als eine Modifikation Reporter dient. Folglich kann PTM-Mapping durch Befolgen der charakteristischen chemischen Verschiebung Verschiebung der entsprechenden funktionellen Gruppe durchgeführt werden "Erfassen", um die Änderung in der chemischen Umgebung. In den meisten Fällen sowohl NH und CH chemischen Gruppen können die Entwicklung des PTM von Interesse zu berichten, verwendet werden.
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Erzeugung von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Es kombiniert die Flexibilität der NMR – Spektroskopie PTM zur Karte sowohl 1 H- 15 N und 1 H- 13 C – Korrelationsspektren mit der Nutzung von verschiedenen Protein – Affinität – Tags für die Reinigung der rekonstituierten ausgewählten Histon – Komplexen. Bemerkenswert ist, verwendet das Protokoll, das zwei verschiedene Pools eines bestimmten Histon für Nukleosomen Rekonstitution. Diese Pools sind unterschiedlich isotopenmarkierten (eins mit <sup> 15 N, die andere mit 13 C), und sie sind mit einem Polyhistidin fusionierte und einem Streptavidin Affinitätstag, respectively. Ein Tandem – Affinitätsreinigung Schema mit Ni-NTA und Streptavidin-basierte Chromatographie zunächst von Voigt et al. 7 verwendet wird , aus symmetrischen Pendants (1A) asymmetrische Spezies zu reinigen. Asymmetrische Histon Octamere werden anschließend zu rekonstituieren äquivalente nukleosomalen Komplexe (1B), unter Verwendung des Standardsalzdialyseverfahren 14 verwendet. Zusätzlich wird durch das gleiche Verfahren und durch eine der Histon-pools vormodifizierten aufweist, kann eine PTM asymmetrisch auf die resultierende Nukleosomen eingearbeitet werden. Die Umsetzung dieser Substrate mit Histon-modifizierende Enzyme und anschließender NMR-mapping Modifikations Ereignisse ermöglichen die Charakterisierung von Übersprechmechanismen sowohl in-cis (vormodifiziert Histon – copy) und in-trans (unmodified Histon – Kopie) (Abbildung 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Für Nukleosomen Rekonstitution verwendet das aktuelle Protokoll , um eine 165 bp lange DNA – Vorlage , um die 601-Widom Nukleosomen Positioniersequenz 20, aber eine ähnliche Leistung wird erwartet , dass mit verschiedenen Längen von DNA – Matrizen enthalten. Das Protokoll wurde entworfen und verwendet unter Verwendung asymmetrischer Arten von Histon H3. Mit dem gleichen Prinzip kann das Verfahren auch für die anderen Core-Histone angewendet werden und zusätzlich verwendet werden können Komp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) für die Nasslaborfläche Bereitstellung von Infrastruktur und zur Durchführung Experimente und die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung der Arbeit durch ein Forschungsstipendium (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
