Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом побратимов гистонов
Summary
Этот протокол описывает воссоздание нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. В то же время, асимметрично посттрансляционно модифицированные нуклеосом могут быть получены после того, как с помощью premodified гистонов копии. Эти препараты могут быть легко использованы для изучения механизмов изменения перекрестных помех, одновременно на обеих сестринских гистонов, с помощью высокого разрешения ЯМР-спектроскопии.
Abstract
Асимметрично модифицированные нуклеосомы содержат две копии гистонов (сестра гистонов), украшенные различными наборами посттрансляционных модификаций (PTMs). Они вновь выявленных видов с неизвестными средствами создания и функциональных последствий. Современные аналитические методы являются недостаточными для обнаружения копий конкретных появление PTMs на нуклеосомной сестра гистонов. Этот протокол представляет собой биохимический метод для восстановления в пробирке нуклеосом , содержащих дифференциально меченого изотопом сестра гистоны. Сформированный комплекс может быть также асимметрично изменен, после включения premodified гистонов бассейн во рефолдинга гистонов подкомплексах. Эти асимметричные нуклеосом препараты могут быть легко реагирует с гистонов модифицирующих ферментов для изучения механизмов Наводки модификации, налагаемых асимметрично предварительно включенного PTM с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В частности, реакции модификации вв режиме реального времени могут быть отображены независимо друг от друга на двух сестринских гистонов, выполняя различные типы корреляции ЯМР-экспериментов, адаптированной для соответствующего типа изотопов. Эта методика обеспечивает средства для изучения переходных помех механизмы, которые способствуют образованию и распространению асимметричных моделей PTM на нуклеосомных комплексов.
Introduction
Эукариотической ДНК плотно упакована в ядрах клеток в хроматин. Фундаментальным строительным блоком хроматина является нуклеосомная ядро частицы, которая содержит ~ 147 п.н. ДНК, обернутой вокруг октамерной комплекса, состоящего из двух экземплярах, каждый из четырех основных гистонов (Н3, Н4, H2A, H2B). Гистонов белки питают множество посттрансляционных модификаций (PTMs). Эти ковалентные замены вызывают изменения в структуре хроматина, как непосредственно влияет на физическую химию системы , так и косвенно за счет привлечения хроматина ремоделирования деятельности 1, 2, 3. К этим средствам, гистонов PTMs контролировать доступность хроматина и, следовательно, регулировать все ДНК на основе клеточных функций 4.
PTMs устанавливаются гистонов модифицирующие ферментных систем в основном на неструктурированных N-концевых сегментов (хвостов) нуклеосом внедренной основной гистоуказанные в другом месте. Из – за многих модификаций участков на относительно короткой последовательности гистонов, PTMs влияют друг на друга за счет индукции или блокирования последующих реакций в модификации, эффект , известный как модификация перекрестных помех 5. Из-за общей симметричной архитектуры нуклеосомой, были мысли модификации реакции и механизмы перекрестных помех происходит аналогичным образом на двух копий каждого нуклеосомной гистона (сестра гистонов). Эта концепция была недавно оспорена и впоследствии опровергнуты. В частности, в пробирке ферментативные анализы на свободный гистонов H3 хвостовых пептидов и на нуклеосом показали , что множество Н3 киназ введена фосфорилирования в асимметричной форме 6. Кроме того, аффинно очистки на основе анализа ЖХ-МС / МС показали существование асимметрично H3-метилированных нуклеосом в нескольких типах эукариотических клеток 7. Таким образом, асимметрично модифицированные нуклеосом образуют новые виды, иинструменты необходимы, чтобы раскрыть механизмы, которые контролируют их формирование и анализ эффектов перекрестных помех, что эта асимметрия может оказывающие.
Как правило, вестерн-блоттинга (ВБ) и масс-спектрометрического анализа (МС), были использованы для обнаружения гистонов PTMs. Несмотря на легкое применение, ВБ страдает от проблем специфичности / перекрестной реактивности. Кроме того, он не способен выполнять одновременный анализ нескольких PTM и прямой количественной оценки реакций модификации 8. С другой стороны, анализ MS использует сложное оборудование , которое требует обучения на высоком уровне, но и обеспечивает высокую специфичность, а также одновременное отображение и количественной оценки множественных PTMs 9. Тем не менее, оба метода разрушительный и нуклеосомной комплексы диссоциируют перед проведением анализа, что приводит к смеси гистонов и / или гистонов производных пептидов. Эта манипуляция устраняет способность различать независимыйРеакции модификации, которые происходят на каждой из двух сестринских гистонов и сообщить о копии конкретного статус модификации нуклеосомной гистонов.
Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) эволюционировали в качестве альтернативного метода для сопоставления реакций PTM. ЯМР без нарушения и таким образом позволяет осуществлять мониторинг событий PTM в режиме реального времени способом , в разведенной смеси, и даже в интактных клетках 10, 11. Разработка процедур для быстрого сбора данных, а также для отображения с высокой разрешающей способностью на основе на 2D гетероолигомере ядерные методы корреляции меченого изотопом (15 Н и / или 13 С) образцов 12 позволило одновременное отображение различных типов PTMs, такие как серин / треонин / фосфорилирования тирозина, лизина ацетилирование / метилирования и аргинина метилирования 13. В зависимости от ПТМ под следствием, 15 N- или 13 C-мечение прotocols могут быть использованы, чтобы отметить функциональную группу белка, который служит в качестве модифицирующей репортера. Следовательно, отображение ПТМ может быть выполнена следующим характеристическую химического сдвига смещения соответствующей функциональной группы 'воспринимая' Чередование на химическую среду. В большинстве случаев, как NH и CH химические группы могут быть использованы, чтобы сообщить эволюцию PTM интереса.
Текущий протокол описывает генерацию нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. Она сочетает в себе гибкость ЯМР – спектроскопии для отображения PTMs , используя как 1 Н- 15 N и 1 Н- 13 корреляции спектров C с использованием различных тегов сродства белка для очистки выбранных реконструированных гистонов комплексов. Следует отметить, что протокол использует два различных пулов определенного гистона для нуклеосомнои восстановления. Эти бассейны дифференцированно меченого изотопом (один с <suр> 15 Н, а другой с 13 С), и они слиты с полигистидиновая и стрептавидин аффинной метки, соответственно. Тандем сродства схема очистки с Ni-NTA и стрептавидин на основе хроматографии первоначально использовалась Voigt и др. 7 используется для очистки асимметричный вид от симметричных аналогов (Рис . 1А) Асимметричные гистонов октамеры используются в дальнейшем для восстановления эквивалентных нуклеосомной комплексов (рис 1b), с использованием стандартной солевой метод 14 диализный. Кроме того, с помощью той же процедуры, и при наличии одного из пулов гистонов предшествующих тем редактированию, ПТМ, могут быть включены асимметрично на полученную нуклеосом. Взаимодействие этих субстратов с гистонов модифицирующих ферментов и последующего ЯМР-картирования модификации событий позволяют охарактеризовать механизмы перекрестных помех как в-цис (premodified гистонов копия) и транс (unmodifiред гистонов копия) (рис 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Для нуклеосомнои восстановления, текущий протокол использует шаблон ДНК длиной 165 пар оснований, содержащий 601-Видомом последовательность 20 нуклеосома позиционирования, но аналогичные показатели , как ожидается , с использованием различных длин ДНК – матриц. Протокол был ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор благодарит д-р Филипп Selenko (ФСМ-Берлин) для обеспечения влажной лабораторного пространства и инфраструктуры для проведения экспериментов и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) для финансирования работы через исследовательского гранта (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
References
- Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
- Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
- Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
- Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
- Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
- Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
- Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
- Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
- Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
- Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
- Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
- Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
- Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
- Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
- Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).
