Reconstituição de Nucleosomes com Histones irmã diferencialmente Isotope-rotulados
Summary
Este protocolo descreve a reconstituição de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. Ao mesmo tempo, nucleossomas assimetricamente pós-translacionalmente modificados pode ser gerado após o uso de uma cópia da histona premodified. Estas preparações podem ser prontamente usadas para estudar os mecanismos de modificação de diafonia, simultaneamente em ambas as histonas irmã, utilizando espectroscopia de RMN de alta resolução.
Abstract
nucleossomos assimetricamente modificados contêm as duas cópias de uma histona (histonas irmã) decorados com conjuntos distintos de modificações pós-traducionais (PTMS). Eles são recém-espécie identificada com meios desconhecidos de estabelecimento e implicações funcionais. métodos analíticos correntes são insuficientes para detectar a ocorrência específica contra cópia de PTMs sobre as histonas nucleossomais irmã. Este protocolo apresenta um método bioquímico para a reconstituição in vitro de nucleossomas contendo histonas irmã isotopicamente marcados diferencialmente. O complexo gerado também pode ser assimetricamente modificada, após a inclusão de uma piscina histona premodified durante a redobragem de subcomplexos histonas. Estas preparações nucleossomos assimétricos podem estar prontamente reagiu com enzimas modificadoras de histonas para estudar modificação mecanismos de cross-talk impostas pela PTM assimetricamente pré-incorporados usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Em particular, as reacções de modificaçãoEm tempo real pode ser mapeado de forma independente nas duas histonas irmã através da realização de diferentes tipos de experiências de correlação de RMN, adaptados para o respectivo tipo de isótopos. Esta metodologia proporciona os meios para estudar os mecanismos de diafonia que contribuem para a formação e propagação de padrões PTM assimétricos em complexos nucleossomais.
Introduction
ADN eucariótico está firmemente embalados dentro de núcleos celulares em cromatina. O bloco de construção fundamental da cromatina é a partícula de núcleo que contém nucleossoma ~ 147 pb de ADN envolvida em torno de um complexo octam�ica constituído por duas cópias de cada um dos quatro histonas nucleares (H3, H4 e H2A, H2B). proteínas histona abrigar uma variedade de modificações pós-traducionais (PTMs). Estas substituições covalentes induzir alterações na estrutura da cromatina, tanto directamente ao afectar a química física do sistema e, indirectamente, através do recrutamento de actividades de remodelação da cromatina 1, 2, 3. Por esses meios, PTMs histonas controlar a acessibilidade da cromatina e, portanto, regular todas as funções celulares 4 baseados em DNA.
PTMs são instalados por sistemas de enzimas de modificação de histonas principalmente sobre os segmentos do terminal N não estruturados (caudas) de histo núcleo incorporou-nucleossomanes. Devido aos muitos locais de modificação no relativamente curta sequência de caudas das histonas, PTMs influenciam uns aos outros através da indução ou bloqueando reações posterior modificação, um efeito conhecido como modificação cross-talk 5. Devido à arquitectura geral simétrica do nucleossoma, reacções de modificação e os mecanismos de diafonia foram pensados para ocorrer de forma semelhante para as duas cópias de cada histona nucleossomal (histonas irmã). Este conceito foi recentemente desafiado e posteriormente refutadas. Particularmente, in vitro ensaios enzimáticos sobre peptídeos cauda H3 histonas livre e em nucleossomos demonstraram que um conjunto de quinases H3 introduzido fosforilação de forma assimétrica 6. Adicionalmente, análise por LC-MS / MS com base em afinidade de purificação revelado a existência de nucleossomas assimetricamente metilada-H3 em vários tipos de células eucarióticas 7. Assim, nucleossomas assimetricamente modificados constituem novas espécies, eferramentas são necessárias para desvendar os mecanismos que controlam a sua formação e para analisar os efeitos crosstalk que esta assimetria pode exercer.
Comumente, Western Blotting (WB) e análise de espectrometria de massa (MS) foram utilizados para detectar PTMs histonas. Apesar de sua fácil aplicação, WB sofre de problemas de especificidade / reatividade cruzada. Em cima disso, é incapaz de realizar a análise multi-PTM simultânea e quantificação direta das reações de modificação 8. Por outro lado, a análise MS emprega instrumentação sofisticada que requer a formação de alto nível, mas proporciona uma elevada especificidade, assim como o mapeamento simultâneo e quantificação de múltiplos PTMs 9. No entanto, ambos os métodos são perturbadores e os complexos são dissociados nucleossomais antes da análise, dando origem a uma mistura de histonas e / ou péptidos derivados de histona. Esta manipulação remove a capacidade de distinguir independentereacções de modificação que ocorrem em cada um dos dois histonas irmã e para relatar o status de modificação específicos de cópia das histonas nucleossomais.
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) nuclear evoluiu como um método alternativo para mapear reacções PTM. NMR é sem interrupções e, portanto, permite o monitoramento de eventos da PTM de uma forma em tempo real em misturas reconstituídos, e até mesmo em células intactas 10, 11. O desenvolvimento de rotinas para aquisição de dados rápida, bem como para o mapeamento de alta resolução com base em 2D métodos de correlação hetero-nuclear de amostras com isótopos marcado (15 N e / ou 13 C) 12 permitiram o mapeamento simultânea de diferentes tipos de PTMs, tais como serina / treonina / fosforilação da tirosina, lisina acetilação / metilação, arginina e metilação 13. Dependendo da PTM sob investigação, 15 N- ou 13 C-rotulagem protocols pode ser utilizado para marcar a proteína de grupo funcional que serve como um repórter modificação. Por conseguinte, o mapeamento PTM pode ser realizada seguindo o deslocamento do desvio químico característico do grupo funcional correspondente "sensing" a alteração no ambiente químico. Na maioria dos casos, ambos os grupos NH e CH químicas pode ser usada para informar a evolução da PTM de interesse.
O protocolo atual descreve a geração de nucleossomos contendo histonas irmã marcados com isótopos de forma diferenciada. Ela combina a flexibilidade da espectroscopia de RMN para mapear PTMs usando tanto um H- 15 N e 1 H- 13 C espectros de correlação com a utilização de diferentes marcadores de afinidade da proteína para a purificação dos complexos de histona reconstituídos seleccionados. Notadamente, o protocolo emprega duas piscinas diferentes de uma histona especial para reconstituição nucleossomo. Estas piscinas são diferencialmente marcado com isótopo (com um <suP> 15 N, o outro com 13 C), e eles são fundidos com um poli-histidina e uma etiqueta de afinidade estreptavidina, respectivamente. Um esquema de purificação por afinidade em tandem com Ni-NTA e cromatograf ia à base de estreptavidina inicialmente utilizado por Voigt et al. 7 é empregue para purificar homólogos de espécies assimétrica simétrico (Figura 1A). Oct�eros histonas assimétricos são utilizados posteriormente para reconstituir complexos nucleossomais equivalentes (Figura 1B), utilizando o método de diálise sal padrão 14. Além disso, através do mesmo procedimento e por ter uma das piscinas histona pré-modificados, um PTM pode ser incorporado de forma assimétrica para os nucleossomas resultantes. A reacção destes substratos com as enzimas modificadoras de histonas e subsequente RMN-mapeamento de eventos de modificação de permitir a caracterização dos mecanismos de diafonia, tanto em cis-(cópia histona premodified) e na trans-(unmodificópia Ed histona) (Figura 1C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Para a reconstituição nucleossomo, o protocolo atual utiliza um modelo de DNA longo de 165 pb contendo o 601-Widom sequência posicionamento nucleosome 20, mas o desempenho semelhante é esperado usando vários comprimentos de modelos de DNA. O protocolo foi projetado e ao serviço que utilizam tipos assimétricos de histona H3. Com o mesmo princípio, o método pode ser aplicado também a outras histonas nucleares e, adicionalmente, pode ser utilizado para reconstituir os complexos que transpo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor agradece o Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlim) para fornecer espaço de wet-lab e infra-estrutura para realizar experimentos e Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) para financiar o trabalho através de uma bolsa de investigação (LI 2402 / 2-1).
Materials
| Unfolding Buffer | 7M guanidinium HCl | ||
| 20mM Tris pH7.5 | |||
| 10mM DTT | |||
| Refolding Buffer | 10mM Tris pH7.5 | ||
| 2M NaCl | |||
| 1mM EDTA | |||
| 2mM DTT | |||
| Assay Buffer | 25mM NaxHxPO4 pH6.8 | ||
| 25mM NaCl | |||
| 2mM DTT | |||
| Guanidinium HCl | Applichem | A14199 | Use high quality Gu-HCl |
| Tris | Roth | 4855.2 | |
| DTT | Applichem | A1101 | |
| NaCl | VWR chemicals | 27810.364 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Na2HPO4 | Applichem | A1046 | |
| NaH2PO4 | Applichem | A3902 | |
| Imidazole | Applichem | A1073 | |
| d-Desthiobiotin | Sigma | D1411 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 1034557 | |
| Strep-Tactin Superflow | IBA | 2-1207-001 | |
| His-probe antibody | Santa Cruz | sc-8036 | |
| Strep-tactin conjugated HRP | IBA | 2-1502-001 | |
| Hi-Load 16/600 Superdex 200pg | GE Healthcare | 28-9893-35 | |
| 6-8kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 1, 132650 | |
| 50kDa dialysis membrane | Spectrumlabs | spectra/por 7, 132129 | |
| 10kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC901024 | |
| 30kDa centrigugal filter unit | Merck Millipore | UFC903024 | |
| Solution-state NMR spectrometer | at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe |
References
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