Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen
Summary
Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.
Abstract
Opheldering van de bindende eigenschappen van chromatine-targeting eiwitten kunnen zeer uitdagend vanwege de complexe aard van de chromatine en het heterogene karakter van de meeste zoogdieren chromatine-aanpassen complexen. Om deze hindernissen te overwinnen, hebben wij een sequentiële zout winning (SSE) assay voor het evalueren van de relatieve bindende verwantschappen van chromatine-gebonden complexen aangepast. Deze test gemakkelijk en eenvoudig kan worden gebruikt door niet-deskundigen om te evalueren van het relatieve verschil in bindende affiniteit van twee verwante complexen, de veranderingen in de affiniteit van een complex als een onderdeel verloren is gegaan of een per individueel domein wordt geïnactiveerd en de verandering in bindende affiniteit na veranderingen in het landschap van de chromatine. Door sequentieel schorsing opnieuw bulk chromatine in steeds grotere hoeveelheden zout, kunnen we de elutie van een bepaald eiwit van chromatine profile. Met behulp van deze profielen, zijn wij in staat om te bepalen hoe wijzigingen in een complex van chromatine-aanpassen of veranderingen in het milieu van de chromatine van invloed zijn op bindende interacties. SSE koppeling met andere tests in vitro en in vivo , we kunnen het vaststellen van de rollen van afzonderlijke domeinen en eiwitten op de functionaliteit van een complex in een verscheidenheid van chromatine omgevingen.
Introduction
Verordening van het DNA in eukaryote cellen is een ingewikkelde en geavanceerde systeem dat strak wordt beheerd door een assortiment van proteïnen toe die reacties op intracellulaire en extracellulaire stimuli coördineren. DNA is gewikkeld rond Histon octamers aan vorm nucleosomes, die losjes kunnen worden gedistribueerd langs DNA of gecomprimeerd in strakke spoelen1. Deze structurele regeling van DNA en histonen staat bekend als de chromatine, die wordt geregeld door een netwerk van proteïnen toe die lezen, schrijven en wissen van bericht vertalende wijzigingen (PTM) op histonen2. Sommige Histon PTMs, zoals acetylation, wijzigen de lading van het aminozuur dat ze worden afgezet, veranderen van de interacties tussen histonen en DNA2. Histon PTMs dienen ook te werven transcriptionele regelgevers, chromatine remodelers, DNA schade reparatie machines en DNA replicatie machines voor specifieke gebieden van het genoom3.
De meeste methoden voor het bestuderen van de chromatine interacties sonde kleinschalige interacties of grote genoom-brede analyse te betrekken. In vitro studies van bindend gebruiken vaak individuele recombinante domeinen met Histon peptiden of DNA in assays zoals elektroforese mobiliteit shift assays (EMSA), isothermische titratie calorimetrie, fluorescentie polarisatie en peptide pulldowns. Omdat deze gehaltebepalingen typisch op een individuele eiwit-domein richten, zij vergemakkelijken het begrip van een klein stukje van de puzzel, maar niet toestaan ons te begrijpen van de coöperatieve aard van meerdere domeinen eiwitten, laat staan hun rol in meerdere eiwit complexen. Een andere laag van complexiteit wordt toegevoegd door de heterogene samenstelling van de meeste zoogdieren chromatine-aanpassen complexen. Deze heterogeniteit van eiwitten, maakt in combinatie met het dynamische karakter van het landschap van de chromatine, het uitdagend om te recapituleren de in vivo interacties van chromatine eiwitten binden aan chromatine in vitro.
In vivo methoden hebben gemaakt vooruitgang; ze zijn echter vaak duur, tijdrovend en technisch uitdagende. Chromatine immunoprecipitation gevolgd door sequencing (ChIP-seq) is zeer nuttig voor de bepaling van de lokalisatie van eiwitten en histone modificaties in het genoom, maar het vereist aanzienlijke optimalisatie4. Eiwitten zijn vaak kruisverwijzende aan chromatine te behouden interacties; echter dit kunstmatige interacties kan produceren en epitoop maskeren5kan veroorzaken. Bovendien, de immunoprecipitations (IP) vereist zeer specifieke antilichamen en uitgebreide optimalisatie van DNA schuintrekken en IP-voorwaarden door ChIP-qPCR met behulp van een bekende bindende site, die vaak niet beschikbaar een priori is. Na optimalisatie van ChIP voorwaarden, verwerking van de monsters is kostbaar en vereist enkele weken tot maanden volgnummer te analyseren. Hoewel deze methode is van onschatbare waarde voor het identificeren van de lokalisatie van de chromatine eiwitten gebonden in het genoom, de kosten en tijd inzet maken het onbetaalbaar te gebruiken deze methode voor het genereren van hypothesen over hoe de kleine wijzigingen van invloed kunnen zijn op de internationale bindende eigenschappen .
In dit artikel beschrijven we hoe een sequentiële zout winning (SSE) assay te onderzoeken van globale bindende profielen van chromatine-gebonden eiwitten en onderscheiden hoe wijzigingen in een eiwit, complexe of global PTM profiel interacties kunnen veranderen kan worden gebruikt. Hoewel zout extracties een algemeen en in het algemeen gebruikte techniek zijn, we laten zien hoe deze sequentiële methode is zeer reproduceerbaar en veelzijdig. SSE laat ons toe om karakteriseren hoe een enkele subeenheid van een complex of zelfs een enkel domein draagt bij aan de algehele affiniteit van het complex voor bulk chromatine. SSE kan ook worden gebruikt om te bepalen als de binding van een eiwit wordt beïnvloed door veranderingen in de chromatine landschap, bieden interessante hypothesen voor het targeten van Histon mark die kunnen worden bevestigd met behulp van de ChIP-seq en andere genoom-brede studies.
We oorspronkelijk aangepast deze methode van Wu et al., te onderzoeken van de functie van Polybromo1 (PBRM1) in de binding van de PBAF chromatine remodeler6,7. Met behulp van deze techniek, we bepaald de rol van PBRM1 voor de chromatine binding binnen de PBAF chromatine remodeling complexe en vervolgens bepaald de relatieve bijdrage van de zes afzonderlijke bromodomains aan deze functie7.
Hier beschrijven we hoe het optimaliseren van deze methode om te verkennen van de binding van de chromatine in verschillende soorten cellen, om te beoordelen van de affiniteit van de relatieve binding van soortgelijke chromatine wijzigen complexen, te onderzoeken van de verplaatsing van een eiwit van chromatine door een chemische inhibitor, en om te bepalen van de effecten van chromatine bindend na veranderingen in het landschap van de chromatine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karakterisatie van eiwitten en chromatine interacties via zout extracties is een gemeenschappelijke methode die heeft gewerkt voor decennia14,15; echter, het is niet systematisch geoptimaliseerd voor te onthullen zijn volle nut. We laten zien hoe deze sequentiële methode biedt een snelle en goedkope manier te onderscheiden van wijzigingen in de chromatine bindend wanneer het eiwit of het milieu wordt gewijzigd. SSE is zeer flexibel en optimaliseerbare, en nog be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een V geleerde award (V2014-004) en een V geleerde plus award (D2016-030) van de Stichting V voor kankeronderzoek, en een Amerikaans kanker maatschappij institutionele onderzoeksbeurs (ACS IRG Grant 58-006-53) aan de Purdue University Center for Cancer Onderzoek. E. G. P. werd gesteund door de Borch Graduate Endowment Award aan de Purdue University medicinale chemie en moleculaire farmacologie departement.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes–many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -. M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta – Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
