Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos
Summary
Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.
Abstract
Elucidação das propriedades de ligação de proteínas da cromatina-direcionamento pode ser muito desafiador devido à natureza complexa da cromatina e a heterogeneidade dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Para superar estes obstáculos, adaptámos um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) para avaliar as afinidades de ligação relativo dos complexos ligados a cromatina. Este ensaio fácil e simples pode ser usado por não-especialistas para avaliar a diferença relativa na vinculação afinidade de dois complexos relacionados as mudanças na afinidade de um complexo quando uma subunidade é perdida ou um domínio individuais é inativado e a mudança na afinidade de ligação após alterações à paisagem da cromatina. Suspendendo sequencialmente re-cromatina em massa no aumento da quantidade de sal,… somos capazes de perfil de eluição de uma proteína específica da cromatina. Usando esses perfis, somos capazes de determinar como as alterações em um complexo de cromatina-modificando ou alterações no ambiente de cromatina afetam as interações de ligação. SSE de acoplamento com outros ensaios in vitro e em vivo , podemos determinar os papéis de domínios individuais e proteínas sobre a funcionalidade de um complexo em uma variedade de ambientes de cromatina.
Introduction
Regulamento de ADN em células eucarióticas é um sistema complexo e sofisticado que é rigidamente controlado por uma variedade de proteínas que coordenar as respostas aos estímulos intracelulares e extracelulares. DNA é acondicionada em torno do histone octamers para os nucleossomas formulário, que podem ser livremente distribuídos ao longo do DNA ou compactados em bobinas apertado1. Este arranjo estrutural do DNA e histonas é conhecido como cromatina, que é regulada por uma rede de proteínas que ler, escrever e apagar post modificações translacional (PTM) em histonas2. Alguns histona PTMs, tais como a acetilação, mudar a carga de aminoácidos que são depositados, alterando as interações entre histonas e DNA2. Histona PTMs servem também para recrutar reguladores transcricionais, empresas de reestruturação da cromatina, maquinaria de reparo de dano de DNA e maquinaria de replicação do DNA para regiões específicas do genoma3.
A maioria dos métodos para o estudo de interações de cromatina ou sonda interações de pequena escala ou envolvem grandes análises de todo o genoma. Estudos de ligação in vitro , frequentemente, utilizam domínios individuais recombinantes com peptídeos de histona ou DNA, em ensaios, tais como ensaios de turno electroforese mobilidade (EMSA), Calorimetria de Titulação Isotérmica, polarização de fluorescência e peptídeo pulldowns. Porque estes ensaios geralmente se concentram em um domínio de proteínas individuais, eles facilitam a compreensão de uma pequena peça do puzzle, mas não nos permitem compreender a natureza cooperativa de proteínas de vários domínios, muito menos seu papel em várias proteínas complexos. Outra camada de complexidade é adicionada pela composição heterogênea dos mamíferos mais complexos de cromatina-modificando. Esta heterogeneidade de proteína, em combinação com a natureza dinâmica da paisagem da cromatina, torna desafiador para recapitular o na vivo vinculando interações de proteínas da cromatina a cromatina em vitro.
Métodos in vivo têm feito avanços significativos; no entanto, eles são muitas vezes caro, demorado e tecnicamente desafiador. Imunoprecipitação da cromatina, seguida por sequenciamento (ChIP-seq) é muito útil para determinar a localização de proteínas e modificações do histone através do genoma, porém requer substancial otimização4. As proteínas são frequentemente quitosana a cromatina para preservar as interações; no entanto, isto pode produzir interações artificiais e pode causar o epítopo mascaramento5. Além disso, as moleculas (IP) requerem anticorpos altamente específicos e otimização extensiva de DNA cisalhamento e condições IP por ChIP-qPCR usando um sítio de ligação conhecida, que muitas vezes não é disponível a priori. Após a otimização das condições de ChIP, processamento das amostras é dispendioso e requer várias semanas ou meses para sequenciar e analisar. Embora este método é inestimável para identificar a localização da cromatina ligado proteínas através do genoma, o custo e compromisso de torná-lo proibitivo para usar esse método para gerar hipóteses sobre como pequenas mudanças podem afetar Propriedades de associação global .
Neste artigo, descrevemos como um ensaio de extração de sal sequencial (SSE) pode ser usado para examinar os perfis de ligação global de proteínas da cromatina-limite e distinguir como as alterações em uma proteína, complexo, ou global PTM perfil podem alterar interações. Apesar de extração de sal é uma técnica comum e amplamente utilizada, demonstraremos como esse método sequencial é altamente reprodutível e versátil. SSE nos permite caracterizar como uma única subunidade de um complexo ou até mesmo um único domínio contribui para afinidade geral do complexo da cromatina em massa. SSE pode também ser usado para determinar se a ligação de uma proteína é influenciada pelas alterações na paisagem de cromatina, fornecendo hipóteses interessantes para o direcionamento de marca de histona que podem ser confirmados usando ChIP-seq e outros estudos de ampla do genoma.
Adaptamos, originalmente, esse método de Wu et al., para examinar a função de Polybromo1 (PBRM1) na ligação do PBAF cromatina remodeler6,7. Usando esta técnica, determinou o papel de PBRM1 para ligação de cromatina dentro a cromatina PBAF remodelação complexa e determinado a contribuição relativa das seis bromodomains individuais para esta função7.
Aqui descrevemos como otimizar esse método para explorar a ligação da cromatina em diferentes tipos de células, para avaliar a afinidade obrigatória relativa da cromatina semelhante modificando complexos, para examinar o deslocamento de uma proteína de cromatina por um inibidor químico, e para determinar os efeitos da ligação de cromatina após alterações à paisagem da cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caracterização das interações da proteína e cromatina através da extração de sal é um método comum que tem sido utilizado por décadas de14,15; no entanto, isso não foi sistematicamente otimizado antes de revelar sua utilidade completa. Vamos demonstrar como este método sequencial fornece uma maneira rápida e barata de distinguir entre alterações na ligação de cromatina quando a proteína ou o ambiente é alterado. SSE é altamente adaptável e o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por um prêmio de estudioso de V (V2014-004) e um estudioso V plus award (D2016-030) da Fundação para pesquisa do câncer de V e um americano câncer sociedade institucional bolsa de investigação (ACS IRG Grant 58-006-53) para o centro da Universidade de Purdue para câncer Pesquisa. E. G. P. foi apoiado pelo prêmio Borch pós doação ao departamento de farmacologia Molecular e Química Medicinal de Universidade de Purdue.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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