Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi
Summary
Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.
Abstract
Aydınlatma proteinleri Kromatin hedefleme bağlama özellikleri Kromatin karmaşık doğası ve en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri türdeş olmayan doğası nedeniyle çok zor olabilir. Bu engelleri aşmak için Kromatin-bağlı kompleksleri göreli bağlama benzeşim değerlendirmek için bir sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil adapte olması. Bu kolay ve basit tahlil sigara-uzmanlar tarafından benzeşme iki ilgili kompleksleri, benzeşim bir kompleks bir alt birim kaybolur veya bir etki alanı denetleyicisindeki inaktive değişimler ve değişikliği bağlama göreli farkı değerlendirmek için kullanılabilir bağlama benzeşme Kromatin manzara için değişiklik sonra. Sırayla tuz miktarda artan toplu Kromatin yeniden askıya tarafından biz Kromatin belirli bir protein elüsyon profil edebiliyoruz. Bu profilleri kullanarak, biz değişiklikler Kromatin değiştirme karmaşık veya değişiklikler Kromatin ortamına bağlama etkileşimleri etkilemesi tespit edebiliyoruz. SSE diğer içinde in vitro ve in vivo deneyleri ile kaplin, biz bireysel etki alanları ve proteinleri Kromatin ortamlarda çeşitli bir kompleks işlevselliğinin rolleri belirleyebilirsiniz.
Introduction
DNA düzenlemesi ökaryotik hücrelerde hücre içi ve hücre dışı uyaranlara yanıt koordine proteinler bir ürün yelpazesine tarafından sıkı bir şekilde kontrol karmaşık ve sofistike bir sistemdir. DNA Histon octamers gevşek DNA dağıtılmış veya sıkı bobinleri1sıkıştırılmış form oluşturarlar için etrafında sarılır. Bu Yapısal düzenleme DNA ve Histon okumanıza, yazmanıza ve sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTM) Histon2silmek proteinlerin bir ağ tarafından düzenlenen Kromatin olarak bilinir. Asetilasyon gibi bazı Histon PTMs, amino asit onlar, Histon ve DNA2arasındaki etkileşim değiştiren yatırılan ücret değiştirin. Histon PTMs aynı zamanda transkripsiyon regülatör, Kromatin remodelers, DNA hasar onarım makineleri ve DNA çoğaltma makineleri genom3özel bölgeler için recruit hizmet.
Kromatin etkileşimleri çalışmak için pek çok yöntem küçük ölçekli etkileşimleri soruşturma veya büyük genom çapında analizleri dahil. Vitro bağlama çalışmalar genellikle bireysel rekombinant etki alanlarında Histon peptidler veya DNA deneyleri Elektroforez hareketlilik shift deneyleri (EMSAN), izotermal titrasyon Kalorimetre, Floresans polarizasyon ve peptid pulldowns gibi kullanmak. Bu deneyleri genellikle bir bireysel protein etki alanında odaklanmak çünkü onlar bulmaca küçük bir parça anlayış kolaylaştırmak, ama çok protein rollerini bırak, birden çok etki alanı proteinler kooperatif doğasını anlamak için bize izin verme kompleksleri. Başka tabaka-in karışıklık en memeli Kromatin değiştirme kompleksleri heterojen bileşimi tarafından eklenir. Bu protein heterojenite Kromatin peyzaj dinamik yapısı ile birlikte bu etkileşimleri Kromatin proteinleri Kromatin içinde vitroiçin bağlama vivo özetlemek için zor yapar.
Vivo yöntemler önemli gelişmeler yaptık; Ancak, pahalı, zaman alıcı ve teknik olarak zor çoğu zaman. Önemli optimizasyon4gerektirir ancak Kromatin immunoprecipitation (ChIP-seq) sıralama tarafından takip çok arasında soykırım, proteinler ve Histon değişiklikleri yerelleştirilmesini belirlemek için kullanışlıdır. Proteinler çoğu kez çapraz Kromatin etkileşimleri korumak için; Ancak, bu yapay etkileşimler oluşturabilir ve5maskeleme epitope neden olabilir. Ayrıca, immunoprecipitations (IP) çok özel antikorlar ve DNA kesme ve ChIP-qPCR genellikle kullanılabilir bir temanındeğildir bilinen bağlama sitesini kullanarak IP koşulları geniş optimizasyonu gerektirir. Optimizasyon çip koşullardan sonra işleme örnekleri maliyetlidir ve ay sıra ve analiz için birkaç hafta gerektirir. Bu yöntem çok değerli olmasına rağmen Kromatin lokalizasyonu tanımlamak için proteinler bağlı genom maliyet ve süre taahhüdü engelleyici küçük değişiklikler küresel bağlama özellikleri etkilemesi hakkında hipotezler oluşturmak için bu yöntemi kullanmak için yapmak .
Bu yazıda, sıralı tuz ayıklama (SSE) tahlil küresel bağlama profilleri Kromatin bağlı proteinlerin incelemek ve bir protein, karmaşık veya genel PTM profil değişiklikleri etkileşimleri nasıl değiştirebilir ayırt etmek için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Tuz çekimi geniş ve yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasına rağmen nasıl sıralı bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve çok yönlü olduğunu göstermektedir. SSE için toplu Kromatin kompleksi’nın genel ilgi nasıl bir kompleks veya hatta tek bir etki alanında tek bir alt birim katkıda karakterize için bize izin verir. SSE bağlama bir protein Kromatin ortamındaki değişikliklerden ChIP-seq ve diğer genom geniş çalışmaları kullanarak doğruladı Histon işareti hedefleme için ilginç hipotezler sağlayan etkilenir eğer belirlemek için de kullanılabilir.
Aslında bu yöntem–dan Wu Polybromo1 işlevinin incelemek için vd., uyarlanmış (PBRM1) bağlama PBAF Kromatin remodeler6,7. Bu tekniği kullanarak, biz PBRM1 rolü için karmaşık remodeling PBAF Kromatin içinde Kromatin bağlamasını belirlenir ve bu işlev7altı bireysel bromodomains göreli katkısını belirledi.
Burada nasıl bir protein Kromatin çıkarılması bir kimyasal inhibitörü incelemek için benzer Kromatin kompleksleri, değiştirme göreli bağlama benzeşme değerlendirmek için farklı hücre tipleri bağlamasında Kromatin keşfetmek için bu yöntem en iyi duruma getirmek için açıklamak ve Kromatin bağlama Kromatin manzara için değişiklik sonra etkilerini belirlemek için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein ve Kromatin etkileşimleri aracılığıyla tuz çekimi karakterizasyonu istihdam edilmiş bir ortak için onlarca yıl14,15yöntemidir; Ancak, bu sistematik olarak daha önce nedeniyle ortaya çıkarmak için optimize edilmiştir değil. Biz göstermek ne kadar hızlı ve ucuz bir şekilde protein veya çevre değiştirildiğinde Kromatin bağlama değişiklikleri ayırt etmek için sıralı bu yöntemi sağlar. Son derece uyumlu ve en iyi hale getirileb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kanser için bir V bilim adamı Ödülü (V2014-004) ve V bilim adamı artı Ödülü (D2016-030) kanser araştırmaları için V Vakfı ve bir Amerikan Kanser Derneği kurumsal araştırma bursu (ACS IRG Grant 58-006-53) Purdue Üniversitesi Merkezi tarafından desteklenmiştir Araştırma. E. G. s. Borch lisansüstü Bağış Ödülü Purdue Üniversitesi tıbbi kimya ve moleküler Farmakoloji bölümü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes–many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -. M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta – Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
