Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar
Summary
Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.
Abstract
Elucidación de las propiedades de enlace de las proteínas dirigida a la cromatina puede ser muy difícil debido a la complejidad de la cromatina y la naturaleza heterogénea de los mamíferos más complejos modificadores de la cromatina. Para superar estos obstáculos, hemos adaptado un análisis de extracción secuencial de la sal (SSE) para la evaluación de las afinidades de unión relativa de complejos enlazados a la cromatina. Este análisis fácil y sencillo pueden utilizarse por usuarios no expertos para evaluar la diferencia relativa en atar afinidad de dos complejos relacionados con los cambios en la afinidad de un complejo cuando una subunidad se pierde o se inactiva un dominio individual y el cambio en afinidad de unión después de alteraciones en el paisaje de la cromatina. Suspendiendo secuencialmente a la cromatina a granel en cantidades crecientes de sal, que son capaces de Perfil de la elución de una proteína particular de cromatina. Con estos perfiles, que son capaces de determinar cómo alteraciones en un conjunto de modificadores de la cromatina o alteraciones en el entorno de cromatina afectan las interacciones de los Unión. SSE de acoplamiento con otros ensayos in vitro e in vivo , podemos determinar las funciones de dominios individuales y proteínas en la funcionalidad de un complejo en una variedad de entornos de cromatina.
Introduction
Regulación de ADN en las células eucariotas es un sistema complejo y sofisticado que está firmemente controlado por una variedad de proteínas que coordinan las respuestas a estímulos intracelulares y extracelulares. ADN se envuelve alrededor de histona octamers a nucleosomas forma, que pueden ser libremente distribuidos a lo largo del ADN o compactados en bobinas apretados1. Este arreglo estructural del ADN y las histonas se conoce como cromatina, que es reglamentada por una red de proteínas que leer, escribir y borrar post traslacional modificaciones (PTM) en histonas2. Algunas histonas MPa, como acetilación, cambiar la carga del aminoácido se depositan, alterando las interacciones entre las histonas y ADN2. PTMs histonas también sirven para contratar los reguladores transcripcionales, remodeladores de la cromatina, maquinaria de reparación del daño de ADN y maquinaria de replicación del ADN en regiones específicas del genoma3.
Mayoría de los métodos para el estudio de las interacciones de la cromatina o sonda interacciones a pequeña escala o implica grandes análisis de genoma. Estudios de Unión in vitro a menudo utilizan dominios recombinantes individuales con péptidos histona o DNA en ensayos como análisis de cambio de movilidad de electroforesis (EMSA), calorimetría isotérmica de titulación, polarización de fluorescencia y jalones de péptido. Porque estos análisis suelen centran en un dominio de proteínas individuales, facilitar la comprensión de una pequeña pieza del rompecabezas, pero no nos permiten comprender la naturaleza cooperativa del multi-dominio proteínas, por no hablar de su papel en múltiples proteínas complejos. Se añade otra capa de complejidad de la composición heterogénea de los mamíferos más complejos modificadores de la cromatina. Esta heterogeneidad de proteína, en combinación con el carácter dinámico del paisaje de la cromatina, es difícil para recapitular el en vivo vinculantes las interacciones de las proteínas de la cromatina de cromatina in vitro.
Métodos in vivo han hecho avances significativos; sin embargo, son a menudo costoso, desperdiciador de tiempo y un desafío técnico. Inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación (ChIP-seq) es muy útil para determinar la localización de proteínas y modificaciones de las histonas en el genoma, sin embargo requiere optimización considerable4. Las proteínas son a menudo reticulado a cromatina para preservar las interacciones; sin embargo, esto puede producir interacciones artificiales y puede causar del epítopo enmascarar5. Además, el immunoprecipitations (IP) requieren anticuerpos altamente específicos y extensa optimización de corte de DNA y condiciones IP por ChIP-qPCR utilizando un sitio de Unión conocido, que a menudo no es disponible a priori. Después de la optimización de las condiciones de la viruta, procesamiento de las muestras es costoso y requiere de varias semanas a meses secuenciar y analizar. Aunque este método es muy valioso para identificar la localización de la cromatina enlazado a proteínas en el genoma, el costo y compromiso de tiempo que sea prohibitivo para utilizar este método para generar hipótesis acerca de cómo pequeños cambios pueden afectar propiedades de enlace global .
En este papel, describimos cómo se puede utilizar un análisis de extracción secuencial de la sal (SSE) para examinar los perfiles de enlace mundial de proteínas de la cromatina-limite y distinguir cómo cambios en un perfil PTM proteínas, complejo o global pueden alterar las interacciones. Aunque la extracción de sal es una técnica común y ampliamente utilizada, demostramos cómo este método secuencial es altamente reproducible y versátil. SSE nos permite caracterizar cómo una sola subunidad de un complejo o incluso un único dominio contribuye a afinidad general del complejo de la cromatina a granel. SSE puede utilizarse también para determinar si la Unión de una proteína está influenciada por cambios en el paisaje de la cromatina, proporciona hipótesis interesantes para histonas marca apuntar que pueden confirmarse mediante ChIP-seq y otros estudios de genoma amplio.
Originalmente adaptado este método de Wu et al., para examinar la función de Polybromo1 (PBRM1) en la Unión de la cromatina PBAF remodelador6,7. Usando esta técnica, determinó el papel de PBRM1 para el atascamiento de la cromatina dentro de la cromatina PBAF remodelación complejo y determina la contribución relativa de los seis bromodomains individuales a esta función7.
Aquí describimos cómo optimizar este método para explorar el atascamiento de la cromatina en diferentes tipos celulares, para evaluar la afinidad relativa de la cromatina similar modificando complejos, para examinar el desplazamiento de una proteína de la cromatina de un inhibidor químico, y para determinar los efectos de la Unión de la cromatina tras alteraciones en el paisaje de la cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caracterización de las interacciones proteína y cromatina mediante extracciones de sal es un método común que ha sido empleado durante décadas14,15; sin embargo, se ha no sido sistemáticamente optimizado antes de revelar su completa utilidad. Demostramos cómo este método secuencial proporciona una manera rápida y barata de distinguir cambios en el atascamiento de la cromatina cuando se altera la proteína o el medio ambiente. SSE es altamente adaptable y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un premio de erudito de V (V2014-004) y un erudito V plus (D2016-030) Premio de la Fundación V para la investigación del cáncer y un americano cáncer institucional investigación beca Society (ACS IRG Grant 58-006-53) al centro de la Universidad de Purdue para el cáncer Investigación. E. G. P. fue apoyado por el Borch posgrado Premio de dotación al Departamento de Farmacología Molecular y Química Medicinal de la Universidad de Purdue.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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