Introduction
人类神经发育障碍,如小头畸形,只能研究甚少在动物模型中由于人类大脑有较长的皮质表面,独特的功能,从非人类动物不同。
该方面使得人脑发育一个复杂的过程,不能被充分研究在2D, 体外细胞培养系统。新兴的3D培养技术允许从诱导的多能干细胞(iPS细胞)的组织样类器官的生成。在3D悬浮培养多能干细胞的体外分化允许各种细胞类型的及时和特定区域的方式形成的,从而产生了一个有组织的,分层组织1,2,3。多亏了3D先锋文化技术和揭秘的器官形成的复杂性,从干细胞开始实验室,我们开发大脑产生对类器官描绘人类大脑发育的早期事件和小头畸形体外 1,2,3模型的鲁棒性的方法。值得注意的是,我们适于通过兰开斯特等人开发的原始方法。以产生脑类器官1。这种方法是根据我们的实验要求进行修改。
从加布里埃尔等人的一项研究的目的。是分析大脑发育过程中的神经干细胞维持的细胞和分子机制。为了做到这一点,一种机械的研究是通过分析在从一个小头畸形患者4衍生的三维大脑类器官的神经祖细胞(NPC)进行。这个病人在CPAP,中心体生物发生所需要5保守中心体蛋白进行的突变。一个被广泛接受的低论点是,小头畸形是NPC池的耗尽的结果,这可能是由于无论是细胞死亡或过早分化1,6,7,8,9。
通过分析头畸形脑类器官的心室区(VZS),已显示的NPC的显著数进行不对称细胞分裂,不同于来自健康供体4衍生的脑类器官。 microcephalic脑组织体的广泛微观和生化分析揭示了及时纤毛拆卸4 CPAP意想不到的作用。具体地,突变的CPAP与延迟纤毛拆卸和延迟细胞周期重新条目相关联,从而导致的NPC 4的过早分化。这些结果表明,在小头畸形和日纤毛作用神经和大脑的大小控制在10 EIR参与。
该协议的第一部分是一个三步骤的方法的描述,以产生均匀的脑类器官。正如前面提到的,原来的兰开斯特协议进行调整和修改,以适应我们的宗旨1。首先,人类iPSC在上Engelbreth-Holm的-群(EHS)矩阵定义的无饲养条件下培养。这一步骤避免了馈线依赖性多能干细胞培养物的变体。在这个协议中,神经分化的诱导以形成神经上皮直接从iPSC的开始。通过跳过胚状体(EB)形成步骤中,以更受控和定向的方式的神经分化前进。该方法限制了其他生殖细胞层,例如中胚层和内胚层的自发和无向的形成。通过施加这个协议中,含有神经花环神经球可以在第5天收获为EHS矩阵的嵌入和固定的悬浮培养。用于我们的协议的第三步骤中的类器官培养基补充有dorsomorphin和SB431542。 Dorsomorphin是骨形态发生蛋白(BMP)的小分子抑制剂,和SB431542抑制TGFβ/激活素/ Nodal信号通路。这些因素的组合可以促进神经分化比更有效地单独11,12,13,14视黄酸。
总之,这些修饰使再现的生成脑组织体,并在保持类器官最小变化。重要的是,施加这种方法来鲁棒地产生从患者的iPSC,其携带突变影响中心体和细胞周期动力学的基因microcephalic脑类器官。
此协议的第二部分发出指令,以制备BR艾因类器官的分析和畸形细胞缺陷的解释。这包括固定,冷冻切片,免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析。该协议会为读者提供了预期结果的详细说明和解释为指导。
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Protocol
1.脑类器官的生成(23天)
- 神经外胚层的启动(5天)
注:以下几点值得分化开始前予以考虑。重编程方法(lentiviral-,仙台病毒,附加体,或微小RNA-基于等 )以获得人类iPSC理想地应为所有患者同一和控制iPSC系。各种重编程工具包,并根据公布的方案说明,请15,16,17,18。人类iPSC系的质量的关键是实现最佳的分化。监测菌落和细胞形态用显微镜和通过测试标记物的表达,如OCT3 / 4,Nanog的,或TRA-1-60验证多能性。- 培养人无饲养条件下的iPSC在介质A上涂覆有Engelbreth-Holm的-群菜(EHS)矩阵。
注:生长人类iPSC无饲养和维持确定的培养条件,并避免对分化开始前除去小鼠胚胎饲养细胞(MEF中)的附加步骤的无血清。对于人类iPSC的最佳通道编号,以从通道15重新编程时开始分化范围到通道70的总额。传代时,分离的hiPSC菌落作为细胞聚集使用具有低机械应力的适当细胞剥离溶液和2毫升血清移液管的聚集体转移到新的培养皿中。避免解离为单细胞,因为这可能会诱导分化和凋亡在大多数iPSC系。据报道,长期,单细胞传代会增加基因组改变在人iPSC 19,20。避免细胞脱离程序,这需要离心步骤以除去剥离液,因为这降低iPSC的整体可行性。测试微生物污染,特别是支原体,定期,所有的文化,因为这可能会改变iPS细胞的质量和分化能力。- 外套60毫米组织培养皿中以EHS矩阵按照制造商的说明书。
- 解冻的1×10 6人类iPSC的等分试样。种子的iPSC在涂在EHS基质和含有5毫升培养基A(参见材料表 )60毫米组织培养皿中。每日更换培养基和传代后5至7天当细胞达到〜80%汇合。
注意:在传代80%汇合使用标准方法,如集落21的不含酶的分离,至少一次在开始分化前的解冻的iPSC。简言之,移除的iPSC介质,具有预温37℃,Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基一次洗涤细胞:营养混合物F12(DMEM / F12),并孵育的iPSC按照生产商的使用试剂A指令(见材料表)。不要为了避免解离为单细胞超过推荐的培养时间。人类iPSC应分离及浮动聚集,而不是单个细胞。然后可以将它们转移到新的EHS基质包被的培养皿;例如,iPSC集聚集来自一个60-mm皿可以被分配到4个新的60-mm培养皿。 - 根据制造商的说明与支原体检测试剂盒检查支原体。只使用无支原体的iPSC,支原体可以改变iPS细胞的分化能力。
- 解离的iPSC(80%汇合),并使用试剂B.制备单细胞悬浮液
- 用预热(37℃)的DMEM / F12洗涤的iPSC一次。
- 添加预热的试剂B( 例如,1毫升在60毫米培养皿)和孵育的iPSC在37℃5分钟和5%CO 2。
- 上的侧部和底部的指尖轻弹20倍培养皿以分离的iPSC。检查细胞在显微镜下分离。
- 用1毫升微量移液管将细胞悬浮液上下在培养皿5倍。
- 加入3毫升培养基A稀释1mL的试剂B和收集细胞悬浮液在15mL的离心管中。
- 轻轻降速的iPSC(500×g下),用于在室温下4分钟。
- 重悬在1mL介质B的细胞沉淀和计数与血球细胞数目。
注意:请注意只使用介质B的再悬浮。避免使用介质A,因为它包含一个过于高浓度的bFGF,这可能会抑制分化。
- 稀释细胞悬浮液,以每毫升4.5×10 5个细胞在培养基B补充有10μMRho相关蛋白激酶抑制剂(Y-27632)。
- 添加每孔100μL在非贴壁,V形底,96孔板。
注:确保细胞均匀分布在SUS通过取出100μL的部分之前每次摇动管退休金。使每孔应包含以获得神经球在尺寸和形状(圆形,限定的表面)均匀的等效细胞数量是重要的。 - 与细胞在500×g下和室温下温和降速板3分钟,并在37℃和5%CO 2孵育。
- 每日通过去除50微升和加入新鲜培养基B的50μL到每个孔中用于接下来5天改变介质。
- 培养人无饲养条件下的iPSC在介质A上涂覆有Engelbreth-Holm的-群菜(EHS)矩阵。
2.嵌入神经球在EHS矩阵(4天)
- 200(V / V)的补充1,1:1:1:1:DMEM / F12和介质C(V / V),1的1:1混合物100(V / V)补充2无(重量/通过以下混合制备神经球介质○)维生素A,1:100 L-谷氨酰胺,0.05 mm,非必需氨基酸(MEM),100U / mL青霉素,100微克/ mL链霉素,1.6 g / L的胰岛素,和0.05mMβ巯基乙醇。
- 收集神经球机智公顷使用〜2毫米尖端200μL微量预先切割用无菌剪刀。
- 放置神经球大约5mm远离彼此上石蜡膜(3×3厘米2)在一个空的100mm培养皿,并小心地取出尽可能剩余的培养基。
- 添加EHS矩阵一滴(7微升)到每个单个神经球。
- 孵育EHS矩阵与用于神经球在培养箱中15分钟下降。
- 通过与神经球中冲洗它们从石蜡膜仔细清洗的神经。要刷新,使用1mL的微量和含有10毫升神经球介质的新百毫米培养皿。
- 孵育神经球在接下来的4天,添加在第2天2毫升的新鲜神经球培养基。
注:确保在孵化器的货架上是平的,这样的EHS基质埋入神经球不会对菜的一侧聚集在一起。
3.在旋转悬挂类器官文化(14天)
- 200(V / V)的补充1,1:100(V / V)补充2 W / O 1:DMEM / F12和介质C(V / V),1的混合物通过以下混合制备脑类器官介质维生素A,1:100 L-谷氨酰胺,0.05毫MEM,100 U / ml的青霉素,100μg/ mL链霉素,1.6 g / L的胰岛素,0.5μMdorsomorphin,5μMSB431542,和0.05mMβ巯基乙醇。
- 加入100毫升脑类器官培养基到每个转瓶中通过其侧臂并将它们放置在用于预热的培养箱中至少20分钟。
- 在25rpm设置搅拌程序,根据制造商的说明。
注:EHS基质埋入神经球转移到转瓶中之前,确保它们都分开。如果两个或多个通过EHS矩阵连接,通过用手术刀切割所述连接矩阵将它们分开。 - 小心转移EHS基质包埋神经球到含有100毫升类器官培养基的旋转烧瓶我们荷兰国际集团2毫升血清移液管。使用旋转瓶的侧臂的神经球转移到烧瓶中。
- 放置在培养箱中的磁搅拌下平台旋转瓶在37℃和5%CO 2;这是化培养的第0天。
- 改变介质每周一次(或更经常时,有一个颜色的变化)通过除去一半的培养基并添加新鲜培养基的相同的量。
注意:当取旋转烧瓶出培养箱,等待3-5分钟,以让类器官下沉到烧瓶的底部。通过将液体的表面上的玻璃移液管尖端(连接到泵)拆下介质;小心通过一个侧部开口/烧瓶的臂吸出培养基。这些操作必须在层流罩下进行。
4.脑组织体分析
- 组织体固定
- 收集转瓶中培养无线的第14天的类器官TH切割1mL的微量(切割约5毫米)。把它们都在60毫米培养皿中并用5毫升温暖的DMEM / F12的一次洗3分钟。
- 制备1.5mL管500μL温暖4%多聚甲醛的(PFA)。
注意:处理PFA固定时,戴上皮肤和眼睛的保护和工作安全罩下。 - 将每个器官样分别在每个管和解决这些问题,在室温下至少30分钟。不要修复类器官的时间超过60分钟。要移动类器官,用接种环或其他任何设计出方便。
- 除去PFA和洗涤固定类器官两次,每次10分钟,用1mL的PBS中。
- 存储在1mL PBS的类器官在4℃至7天,直至进一步使用。
- 嵌入类器官的冷冻切片
- 除去PBS并在每管脱水cryofreezing他们之前的类器官蒸馏水溶液加入1毫升30%蔗糖的;加入SUCRO后SE溶液,所述类器官应在表面上浮动。在4℃下过夜存储类器官中的蔗糖溶液;在第二天,类器官应该已经沉没到管的底部。
注意:可以类器官在4℃如有必要,可以保存长达3-5天在蔗糖溶液。 - 填充400μL最佳切割温度(OCT)化合物的乙烯基标本模具,并使用接种环将一个类器官在模具的中心。标记与样品名称模具的边缘。
- 冷冻在-80℃下的含类器官模直到冷冻切片。
- 用PBS中0.1%的聚-L-赖氨酸溶液(PLL),在室温下5分钟,涂层玻璃cryoslides并让干燥载玻片3小时。在4℃保存幻灯片,使用前预热起来到室温温和。
注:PLL涂层是重要的一步,因为它会阻止该组织体片漂浮之遥。收集并在4℃下存储PLL溶液长达3个月。重新使用前,用0.22微米注射器过滤它,让它温暖至室温。 - 部cryofrozen类器官成20-50微米厚的切片上PLL涂布的玻璃cryoslides 22。让与所述部分中的干燥载玻片在室温下1个小时。在-80℃直到进一步处理存储该部分。
- 除去PBS并在每管脱水cryofreezing他们之前的类器官蒸馏水溶液加入1毫升30%蔗糖的;加入SUCRO后SE溶液,所述类器官应在表面上浮动。在4℃下过夜存储类器官中的蔗糖溶液;在第二天,类器官应该已经沉没到管的底部。
5.类器官切片的免疫荧光染色
注:有关组织体的一般特征,与巢蛋白,神经祖细胞标记,TUJ1,泛神经元标记染色,值得推荐。作为附加示例,免疫荧光染色与磷酸化波形蛋白(P-VIM),哪些标签有丝分裂顶端径向胶质细胞,和Arl13b,为纤毛,进行说明。为了测试细胞凋亡,使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定法。放置在塑料盒中载片温育期间,以保护它们免受灰尘,光,和干燥。
- 解冻载玻片在室温下30分钟。
- 用PBS-甘氨酸200μL(在PBS中0.225克甘氨酸)3分钟洗两次滑动以淬灭PFA诱导的自体荧光。
- 透化切片用/ 0.5%的Triton X100的200μL中在室温下10分钟的PBS溶液0.1%吐温。
- 用3分钟PBS-甘氨酸溶液200微升洗两次。
- 与/ 200μL0.5%鱼明胶的0.1%的Triton X100的PBS孵育它们在室温下或在4℃下过夜1个小时,以封闭非特异性的抗原结合。
注:如果需要TUNEL分析,进行测定按照制造商的方案。进行免疫,因为它可能与第二抗体干扰和以后使用时,荧光淬灭之前与TUNEL法启动。 - 稀释的抗体在阻断以下列浓度溶液:巢蛋白,1:200; P-Vim的,1:500; TUJ1,1:200;Arl13b,1:20;抗体和第二抗体,1:1,000。
- 与所述第一初级抗体的200μL( 例如,巢蛋白)1-2小时,在室温下或在4℃下孵育过夜。
- 洗3×3分钟用封闭溶液的200μL。
- 稀第一(抗小鼠488)的第二抗体1:1000在封闭溶液中孵育在200μL滑动,在室温下1-2小时。从现在起,始终保护将幻灯片从光。
- 洗3×3分钟用封闭溶液的200μL。
- 与下一个初级抗体的200μL( 例如,TUJ1)孵育在室温下1-2小时或过夜,在4℃。
- 洗3×3分钟用封闭溶液的200μL。
- 添加下一个第二抗体(抗 - 兔647)的200μL,在室温下1-2小时。
- 洗3×3分钟。用封闭溶液的200μL。
- 添加200μL的4' ,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在30nM的浓entration的PBS在室温下核染色15分钟。
- 洗2×3分钟用封闭溶液的200μL。
- 洗1×1分钟用蒸馏水200μL,并让部分干燥10-20分钟,直到没有明显的水滴是可见的了。
- 安装与包埋剂的部分。将它们储存在4℃下避光长达数周。
- 与微观分析图像的组织体,脑室区,原始的骨板,以及其他感兴趣的领域的概述进行。
- 使用与63X油浸物镜和荧光滤光器的共聚焦显微镜,根据所使用的1,10中的荧光染料标记的第二抗体选择。
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Representative Results
脑类器官的生成需要至少三周连续培养( 图1A)的。为了实现可重复的结果,我们建议,研究人员记录了每一步,更重要的,避免了关于培养基成分,时间点和细胞处理任何改变。在这里,我们给出了如何在关键的里程碑,是为了在实验结束时获得足够的质量达到类器官评估总结。神经球在96孔板的形成应该是从第4天的神经球能够识别在每个孔的底部( 图1B,步骤1)以及定义球体清晰可见。
在第5天,神经球应为〜直径500微米,表现出光滑的表面,具有围绕中心暗亮边缘。有可能已经观察到神经玫瑰状延伸STRU这个明亮的轮辋内ctures( 图1C,启动步骤2)。如果神经散架或看起来更像细胞聚集,分化不应再继续。最后,类器官应该增加,过程中旋转烧瓶( 图1D,步骤3)分化过程表现出相似的尺寸。见进一步的信息,故障诊断表( 表1)。
14天的组织体质量应通过光学显微镜进行验证。 VZS与在顶侧上的栅栏核形状由巢蛋白阳性的NPC /放射状胶质细胞的厚层。在另一方面,原始皮质板将包含在基侧丰富TUJ1阳性神经元,从顶端侧( 图1E)在空间上不同。重要的是,TUJ1阳性神经元不应在VZ的顶侧看到。
图1F和G)23,24的早期膨胀对称必不可少。当达到足够的膨胀ARG,神经发生开始时,分裂的细胞改变它们的取向朝向内腔,和分割平面从水平(对称的)切换到垂直(非对称)4,12,24。
图1: 由人iPS细胞脑类器官的生成。 (A)该分化方案的工作流程。步骤1:分化的开始。在此阶段,从发生人类iPSC神经球在96孔板的形成。持续时间为5天。步骤2:在嵌入EHS矩阵液滴的神经球。 EHS基质包埋神经球的静止悬浮培养具有4天的持续时间。步骤3:在转瓶类器官。 EHS基质包埋神经球的到旋转烧瓶转移发生。持续时间为14天。 (B)在多孔板神经球。步骤1中,在96孔板中在第4天神经球的代表图像被示出。球体应在孔的底部清晰可见,具有平滑,圆形表面(红ARROW)。 (C)神经球形态EHS之前矩阵嵌入。收集在第1步中的第5天的神经球在尺寸上应均匀,并与明亮的轮辋(支架和箭头)显示光滑的表面。 (D)在类器官旋转瓶中。与步骤期间脑类器官3(红色箭头)旋转瓶在此显示。显示一个典型的VZ和原始皮质冰冻切片板的类器官(E)免疫荧光成像。左图显示在VZ细胞的细胞核染色。的VZ从顶端侧(腔L)到基端侧(黄线)跨越。注意,VZ显示栅栏状核内的细胞,这表明它们是径向神经胶质细胞。右图显示了VZ,并在原始皮质板TUJ1阳性神经元(品红色)内巢蛋白阳性的NPC(绿色)的免疫荧光染色。比例尺=50μm以下。冷冻切片组织体(F)免疫荧光成像。两个例子用p的Vim和Arl13b染色VZS的(I和III)。由白色正方形标记的区域在每个图像插入右侧被放大(II和IV)。后期顶端放射状胶质细胞(参数)的分型面。分割顶端放射状胶质细胞在VZ的顶面是p的Vim阳性(品红色)。用于对称地分割的ARG实例示(白色方块和插图)。分割平面被给定为白线。的后期细胞的分裂平面是水平的管腔表面线(黄色虚线)和由Arl13b染色(绿色)标记的。比例尺=50μm以下。 (G)该示意图提供ARG游戏的相对于腔的后期垂直或水平方向。在第14天的控制类器官的分裂细胞大多水平定向(0-30°)相对于所述VZ的内腔表面。腔的顶侧由argS的初级纤毛,它们指定VZ(绿线)的内腔表面衬里。与此相反,MOS小头畸形类器官的放射状胶质细胞的T个显示垂直取向的(60-90°)分割平面。白线示出了分割平面的轴线。 请点击此处查看该图的放大版本。
问题: | 可能的原因: | 建议: |
步骤1.1.1.2 | 重编程的效率差 | 检查人iPS细胞多能性标志物:如果素质低,手工采摘未分化的菌落几段,以丰富的多潜能菌落 |
人类iPSC分化开始之前分化 | ||
应力由于早期传代或passagi纳克作为单细胞 | 不就是达到80%汇合前的通道。通道作为骨料,没有单个细胞 | |
污染支原体 | 试验支原体污染 | |
第2步 | 人iPS细胞的质量差 | 提高的hiPSC的质量(见上文) |
神经球完全不形成或分化开始后第5天土崩瓦解 | 细胞每孔的起始号码过低或过高 | 准确计数细胞的数量和每个孔中平均分配 |
的hiPSC介质代替神经分化培养基 | 利用神经分化培养基 | |
离心步骤过于苛刻或轻度 | 旋96孔板500×g离心3分钟,并检查细胞在中央积累每孔底部 | |
没有Y-27632在分化的开始 | 使用Y-27632,以增强细胞存活 | |
细胞附着并生长在板的底部 | 确保非粘附96孔V型底板使用。 | |
第2步 | 没有每天换液 | 更改媒体每天的量的一半 |
神经球大小并不均匀 | 起始细胞数量每孔不等于 | 取出100μL的细胞悬浮液之前每次混合使用单细胞悬浮液的管 |
中等变化不是每口井每天做 | 确保每口井每天得换液 | |
第2步 | hiPSC细胞不分离INT在开始分化前o单个细胞 | 检查在显微镜下,如果是的hiPSC ACCUTASE治疗后解离为单细胞。如果仍有聚集,吸管细胞的10倍上下100μL微管,并再次检查或重复治疗ACCUTASE |
神经球不显示明亮的边缘或圆表面上;它们形成在表面大囊肿 | 起始细胞数量每孔太高 | 准确计数细胞的数量和每个孔中平均分配 |
中等变化不是每天都做的每孔 | 媒体每天更换一半 | |
步骤2.7 | 人iPS细胞的质量差 | 提高的hiPSC的质量(见上文) |
EHS矩阵嵌入神经球粘和聚集在一起 | 不够介质(体积) | 提供一个10毫升培养基的最低在100毫米培养皿 |
孵化器的架子甚至没有 | 盘放置在平坦的表面 | |
放置到培养箱后,移动盘,使神经球均匀地分布 |
表1:故障排除表。
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Discussion
MCPH是一个复杂的人类神经发育障碍,不能在动物模型中在体内或在简单的人细胞培养物在体外方法中重现。 MCPH的临床表现开始在第一孕期出现,早期的神经开始时。因此,3D脑组织体代表了可靠的实验系统,MCPH发展模式。此外,三维人体脑组织体是一种理想的方法,因为i)它们允许与各种遗传背景的患者样本的光谱的适配,ⅱ)它们显示包含不同的神经细胞类型组织的组织,并且,重要的是,ⅲ)各种分化在该体外方法神经发育的各阶段都与它们的体内对应物25,26,27。例如,神经花环是等效结构在显影神经管。
兰开斯特等人。用于相对于对照的iPSC为了在生成患者类器官成功患者iPSC的两倍。值得注意的是,在这里所描述的,通过修改现有方法的协议,我们可以生成控制,并从同一手机号码4起小头畸形的脑组织体。这是可能的,因为iPSC的所定义的培养条件,并且由于更定向分化。在这个协议中,类器官代物通过替换通过直接从iPSC的起始神经分化常用进行EB形成步骤的改善。其次,在步骤3中,dorsomorphin和SB431542分别添加到培养基中,而不是单独的视黄酸。当施加到细胞培养基中28视黄酸易于异构化。因此,其生物活性比如dorsomorphin更稳定的化合物的较少定义。 Dorsomorphin抑制所述BMP4信号传导途径,和SB431542是激活素/ Nodal信号途径的抑制剂(TGF-β1ALK抑制剂)。这两种化合物的组合导致了BMP的抑制和活化素/ Nodal信号传导途径,诱导神经分化,并且降低了分化为来自人ES或人iPS细胞的各种细胞系具有类似的效率29其它谱系。化合物的稳定性和通用细胞应答的化合物,是用于建立,可以被应用到不同的患者细胞系对一种疾病的体外模型的协议要点。因此,在均匀的脑鲁棒和有效的分化结果类器官培养物,并最终在更可再现的数据。
具有这些修饰的,在协议中的关键步骤是最小化,以在步骤1在这一点上分化开始,它到的iPSC轻轻解离成单细胞悬浮液中的是非常重要的ND准确和均匀地分配它们到96孔板的每个孔中。 Rho相关蛋白激酶抑制剂(Y-27632),必须在第一个24个小时的过程中加入到媒体B的,因为它在它们的解离为单细胞的iPSC支持的存活。它通过旋转他们下到井的底部,使相互密切接触的细胞是很重要的。一旦神经球在步骤1的端部形成,进一步的实验步骤的成功完成可以预期的。如果神经球不形成,所述人类iPSC的多能性,将细胞在96孔板中,并离心条件的非粘附必须检查。在步骤1的第0天的整个过程应大于1个小时不再采取由于人类iPSC的灵敏度。在随后的几天中的变化时必须小心谨慎,避免纯粹的力量,为了不破坏细胞之间新形成的细胞接触。
值得注意的是,centrosom人突变体具有缺陷的细胞增殖和改变的细胞周期动力学。因此,造型MCPH需要强大的协议,该协议能承受破坏细胞功能。因此,电流协议允许的高品质均匀类器官的生成,并作为一个独特的工具来研究干细胞稳态的VZ。相比于其他协议,该协议使得类器官的生成从控制和患者的iPSC,开始以相等的细胞数目。对于基于在体外分化的研究中,对于不同的iPSC相同的培养条件,以确定疾病相关的改变并避免培养条件伪影的基本要求。除了模拟遗传起源的小头畸形,该协议也可以适用于非遗传起源的小头畸形,包括来自神经营养病毒感染,化学品或辐射。 30此外,现代分子生物学手段,如CRISPR / Cas9基因组编辑荷兰国际集团的技术,可应用于3D类器官解剖人脑发展范例的具体方面在体外 31,32,33。
在另一方面,脑组织体迄今代仍然没有超出人类发展34的第一和早期孕中期。超越这一限制,并允许在体外将开辟新的途径,以一些表现在稍后阶段,如帕金森病或阿尔茨海默氏病神经退行性疾病模型的成熟脑组织体的产生。对于未来的应用程序,协议定向分化为多个特定区域,如前脑或脑,可能会感兴趣的研究复杂的神经系统疾病如孤独症和精神分裂症35,36,37, 38。
重要的是,从组织体的研究中得出结论时,某些方面应该加以考虑。第一个限制是,有在组织体没有明显的血管。因此, 在体外气体交换和营养供应仅近似于体内条件。其次,由于脑组织体没有连接到复杂的器官系统的类器官模型缺乏完整的免疫,代谢和内分泌系统。尽管如此,由于没有这些方面有时提供的优点。例如,这里所描述的组织体可以解决免疫系统的脑疾病的发病机制的影响时替换体内模型免疫抑制。
通过使用旋转烧瓶中,可以为生化实验,全转录组测序分析,和高通量药物筛选中产生了大量的组织体。总之,用u唱该电流协议,可以产生从人类iPSC的细胞,然后可以在宽范围的应用中,从疾病建模药物测试平台,脑类器官为了可靠地更换在未来动物试验。
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Acknowledgments
这项工作是由弗里茨·蒂森基金会(Az.10.14.2.152)的支持。我们感谢组织包埋设施和CMMC的显微镜核心设施。我们是由实验室中心体和细胞骨架生物学的成员提供的讨论和技术支持表示感谢。我们感谢李明Gooi校对稿件。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4 °C |
Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
Inoculation loop with needle, disposable (1 µL) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20 °C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
Spinner flask 250 mL | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers |
TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |
References
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
- Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
- Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
- Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
- Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986 (2014).
- Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
- Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
- Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
- Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307 (2015).
- Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646 (2014).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
- Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
- Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
- Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
- Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
- Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
- Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759 (2016).
- Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
- Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).