Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

Summary

Ici, nous offrons un moyen facile, peu coûteuse et efficace protocole temps pour fixer chimiquement le tissu cérébral des primates avec acroléine fixatif, permettant la conservation à long terme qui est compatible avec l'immunohistochimie pré-enrobage pour la microscopie électronique à transmission.

Abstract

En dépit de toutes les avancées technologiques au niveau de la microscopie optique, la microscopie électronique reste le seul outil en neurosciences pour examiner et caractériser les détails ultrastructuraux et morphologiques des neurones, tels que des contacts synaptiques. Une bonne conservation du tissu cérébral pour la microscopie électronique peut être obtenu par des procédés cryo-fixation rigoureux, mais ces techniques sont plutôt coûteuses et limiter l'utilisation de immunomarquage, ce qui est crucial pour comprendre la connectivité des systèmes neuronaux identifiés. méthodes gel de substitution ont été mis au point pour permettre la combinaison de cryo-fixation avec immunomarquage. Cependant, la reproductibilité de ces approches méthodologiques repose généralement sur des dispositifs de congélation coûteux. De plus, l'obtention de résultats fiables avec cette technique est très consommatrice en temps et compétences difficiles. Par conséquent, le cerveau traditionnel chimiquement fixe, en particulier avec l'acroléine fixatif, reste un temps efficace et méthode peu coûteuse pour combiner électroniquemicroscopie avec immunohistochimie. Ici, nous fournissons un protocole expérimental fiable en utilisant la fixation d'acroléine chimique qui conduit à la préservation du tissu cérébral des primates et est compatible avec immunohistochimie pré-enrobage et de transmission examen au microscope électronique.

Introduction

La microscopie optique, y compris la microscopie confocale et à deux photons, est avérée être un outil efficace pour l' étude in vivo des processus neuronaux, entre autres ^{1, 2.} Bien que la résolution spatiale typique au niveau de lumière microscopique (LM) est d' environ 200 nm, les progrès technologiques récents utilisant différentes sources de lumière, telles que l' ultraviolet extrême et la microscopie à rayons X mous, ont notablement augmenté cette résolution à une résolution spatiale de près de 10 nm ^{3 , 4, 5.} D' autres avancées technologiques dans l' imagerie comprennent l' imagerie par résonance magnétique combinés avec l' histologie et de fournir un nouveau procédé pour mesurer l'épaisseur de la gaine de myéline in vivo, un paramètre qui est traditionnellement mesurable seulement au niveau de microscopie électronique (EM) ^{6, 7.} although ces progrès au niveau des LM fournissent un excellent outil pour l'étude des processus vivants, une vue détaillée et la caractérisation des structures, telles que les contacts synaptiques, ne peuvent être atteints avec EM, qui offre une résolution qui peut atteindre 0,5 nm. Cependant, l'observation au niveau EM exige que les spécimens morts et modifié à certains égards, avec fixateurs chimiques et des procédés de déshydratation, afin de préserver la cytoarchitecture. Ainsi, l' examen d' échantillons biologiques à haute résolution peut être difficile en raison de dégâts d'irradiation du faisceau d'électrons, un faible contraste, les écarts de structure des membranes, ou même la présence d'artefacts qui peuvent se produire suite à l' incorporation déshydratation et époxy ^{8, 9, 10.}

La préservation des spécimens dans leur forme native pour l'analyse structurelle peut être obtenue en utilisant « Cryo EM des sections vitrifiés » ou CEMOVIS, qu'une approche tronçonnageconsiste à congeler rapidement et l' incorporation de l'échantillon dans de la glace vitreuse et en examinant les sections sous le EM à une température cryogénique ^{11, 12.} Cette procédure permet l'examen des échantillons alors qu'ils sont encore solides et totalement hydratée, éliminant ainsi les artefacts causés par des processus de déshydratation ^13. Cependant, cette méthode implique des dispositifs supplémentaires pour cryo-ultramicrotomie, ainsi que des dispositifs supplémentaires sur l'EM standard, afin de permettre cette observation à des températures très basses, qui génèrent des coûts supplémentaires importants. De plus, l'approche CEMOVIS exclut l'utilisation de techniques immunomarquage, car les anticorps doivent généralement être mis en incubation à la température ambiante. Sinon, il est possible de combiner l'analyse ultrastructurale des procédures immunohistochimie en utilisant une approche gel de substitution, au cours de laquelle des échantillons fixés Cryo sont lentement décongelés tout immerged dans les produits chimiques cryo-protecteurs et sont een embarqué dans des résines spécialisées, telles que Lowicryls. Immunomarquage post-enrobage peut ensuite être effectuée sur un tel matériau ^12. Cependant, le gel de substitution et de techniques de cryopréservation fixation prennent beaucoup de temps. Ils nécessitent l'installation d' un équipement supplémentaire et nécessitent encore des échantillons d'être exposés au solvant organique et un fixateur chimique qui peut altérer la cytoarchitecture, malgré l'utilisation d'une basse température ^{14, 15.} Par conséquent, en dépit de toutes les avancées technologiques , tant au niveau LM et EM, fixation chimique du tissu cérébral, en particulier avec l' acroléine, reste un faible coût et une méthode efficace de combiner le temps immunohistochimie avec EM ^16.

Au cours des dernières décennies, de nombreuses tentatives ont été faites pour trouver un mélange d'aldéhydes qui offrent la meilleure conservation des tissus. Avant les années 1960, la seule fixatif chimique qui a donné des résultats acceptables pour EM était osmium tétroxyde. Cependant, tétroxyde d'osmium est hautement toxique et coûteux, ce qui empêche son utilisation dans le système vasculaire pour réparer des organes tels que le cerveau. Acroléine a été introduit dans les années 1950 comme une méthode fiable pour la conservation des tissus animaux appropriés pour l' observation EM des structures cellulaires ^17. Il pénètre dans le tissu plus profondément et réagit plus rapidement que d' autres aldéhydes lorsqu'ils sont utilisés pour la fixation par immersion et permet une bonne conservation des composants cytoplasmiques, avec un retrait minimal du tissu ^17. Une telle caractéristique permet la fixation de l' acroléine un net avantage sur d' autres aldéhydes lorsqu'il est utilisé dans les tissus frais, en permettant une localisation plus précise de la vie des composés moléculaires, tels que des enzymes et d' autres protéines ^18. En effet, il a été validé au fil des ans comme un moyen facile, efficace et méthode peu coûteuse de fixation pour la visualisation au niveau EM dans de nombreuses espèces, y compris les amphibiens et les rongeurs, comme efficacement Stabiliconserve une antigénicité et fournit ultrastructure relativement intact lorsqu'il est utilisé en combinaison avec un autre aldéhyde fixatif ^{16, 18, 19, 20,} des peptides et des protéines de zes, ^21. Protocoles pour la fixation d'acroléine chez les rongeurs ont depuis été normalisés et largement utilisé, en particulier par le groupe Pickel, à mettre en œuvre pour double immunomarquage EM ^{16, 22.} Quelques groupes ont utilisé la fixation de l' acroléine dans le tissu cérébral des primates non humains ^23. Cependant, à notre connaissance, il n'y a qu'un seul protocole publié décrivant efficacement la fixation chimique avec de l' acroléine chez les primates non humains qui est compatible avec EM immunomarquage ^24.

Dans cet article, nous proposons une méthode simple et fiable pour résoudre efficacement chimiquement non-humun cerveau de primate avec acroléine, ce qui permet une conservation potentiellement à long terme ainsi que immunomarquage pré-enrobage et de transmission EM examen.

Protocol

Déclaration éthique: Tous les protocoles impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval et ont été faites conformément au Conseil canadien sur le Guide des animaux de soins sur le soin et l'utilisation des animaux (Ed 2.). Le protocole décrit ici a été optimisé pour les animaux adultes d'environ 800 g. Les volumes de fixatif doivent être ajustées en fonction de la taille de l'animal. 1. Préparation des sol…

Representative Results

Dans cette section, nous présentons les résultats représentatifs qui ont été obtenus suite à l'observation, au niveau de l'EM de transmission, des tissus du cerveau de primate immunocolorées chimiquement fixé avec un mélange de 3% d'acroléine et 4% de PFA. Nous avons obtenu une bonne conservation de l'ultrastructure, comme indiqué par la gaine de myéline relativement intacte et la visualisation nette des doubles membranes (figure 2A). Contacts…

Discussion

Dans cet article, nous présentons un protocole fiable pour la perfusion transcardiaque des primates non humains et immunohistochimie pré-enrobage approprié pour l'examen de l'échantillon EM. Bien que typique cryo-EM, comme CEMOVIS, fournit une bonne conservation des ultrastructure du cerveau, elle limite également l'utilisation de ¹² immunohistochimie. D' autres techniques, y compris cryo-substitution et technique Tokuyaso, permettent immunohistochimie post-intégration, mais…

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4)	Fisher scientific	S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O)	EM Science	SX0710-1
Sodium chloride (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%)	sigma	110221	3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table	Mopec	CE400
Electronic perfusion pump	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamine			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Feather           lance	201011           J9913	No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome	Leica	VT 1200S	Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	30% dilution
Ethylene glycol	Fisher scientific	E178-4	30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4)	sigma	S-9125
Normal horse serum	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% dilution
Cold-fish gelatin	Aurion	900.033	0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT	Santa Cruz biotechnology	SC-1458	1/500 dilution
Primary antibody, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 dilution
Primary antibody, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse	Vector laboratories	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB)	Sigma	D5637	0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4)	Electron microscopic science	2% 19152           4% 19150	Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin	sigma	A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)	Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups	Electron microscopic science	70048-01
Ethanol	commercial alcohols	1019C	Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide	Electron microscopic science	20401	Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides	brain research laboratories	3875-FR	Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film)	Electron microscopic science	50425-25	Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome	Leica UC7	EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim)	Diatome	UT 1081	Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife	Diatome	MC13437	equipped with a boat
Xylenes	Fisher scientific	X5SK-4
150-mesh copper grids	Electron microscopic science	G150-cu
grid-box	Electron microscopic science	71138	Can store up to 100 grids
Sodium citrate	Anachemia	81983
Lead nitrate	sigma	L-6258	Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe	terumo	SS-05L	5 mL
Syringe filter	corning	431222	0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper)	Electron microscopic science	70086-1
Parafilm	Laboratory film	PM-999
Mineral oil	Sigma	M5904