İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması
Summary
Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.
Abstract
ışık mikroskobu düzeyinde tüm teknolojik gelişmelere rağmen, elektron mikroskobu böyle sinaptik kişiler gibi nöronların, ultrastrüktürel ve morfolojik ayrıntılarını incelemek ve karakterize edilmesi sinirbilimindeki tek uygulama. elektron mikroskobu için, beyin dokusunun iyi koruma titiz kriyo-sabitleme yöntemleri ile elde edilebilir, ancak bu teknikler oldukça maliyetlidir ve tanımlanan nöronal sistemler arasında bağlantı anlamak önemlidir immunolabeling kullanımını sınırlar. Dondurularak ikame yöntemleri immunolabeling ile kriyo-tespitin bileşimini sağlamak için geliştirilmiştir. Ancak bu metodolojik yaklaşımların tekrarlanabilirlik genellikle masraflı donma cihazlarda dayanır. Üstelik bu teknikle güvenilir sonuçlar elde çok zaman alıcı ve beceri zorlu olduğunu. Bu nedenle, özellikle akrolein sabitleyici geleneksel kimyasal sabit beyin, elektron birleştirmek için bir zaman etkili ve düşük maliyetli bir yöntem olmaya devam etmektedirimmünhistokimya ile mikroskopi. Burada, primat beyin dokusunun korunması yol açar ve immünohistokimya ve transmisyon elektron mikroskobik inceleme öncesi gömme uyumlu kimyasal akrolein fiksasyonu ile güvenilir bir deney protokolü sağlar.
Introduction
Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Işık mikroskopisi, 2, diğer şeylerin 1 arasında vivo nöronal süreçlerde okuyan için etkin bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Işık Mikroskobik (LM) seviyesinde tipik uzamsal çözünürlük gibi aşırı ultraviyole ve yumuşak X-ışını mikroskopi için farklı ışık kaynaklarını kullanarak yaklaşık 200 nm, son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler olmasına rağmen, özellikle bir, yaklaşık 10 nm uzaysal çözünürlük 3, bu çözünürlük artmıştır , 4, 5. Görüntülemede Diğer teknolojik gelişmeler histoloji ile manyetik rezonans görüntüleme birleştirildi ve in vivo olarak miyelin kılıfının sadece Elektron Mikroskobik (EM) seviyesi 6, 7, geleneksel olarak ölçülebildiği bir parametre kalınlığının ölçülmesi için yeni bir yöntem sağlamaktır içerir. AlthouGH LM seviyesinde bu gelişmeler, örneğin, sinaptik temasların olarak yaşayan işlemleri, yapıları detaylı bir görünümünü ve karakterizasyon incelenmesi için mükemmel bir araç sağlar, 0.5 nm ulaşabilir çözünürlüğe sahip EM ile elde edilebilir. Bununla birlikte, EM seviyesinde gözlem hücre mimarisini korumak amacıyla, kimyasal tespit ve dehidrasyon işlemleri ile, bazı açılardan, ölü ve değiştirilmiş olduğu numuneler gerektirir. Bu nedenle, yüksek çözünürlükte biyolojik örneklerinin incelenmesi bağlı radyasyon elektron ışını hasar, düşük kontrast, membranların yapısal sapma, ya da 8, 9, 10 gömme aşağıdaki dehidrasyon ve epoksi oluşabilir eserler da varlığına zor olabilir.
Yapısal analiz için kendi doğal biçiminde numuneler koruma "Vitrifiye Kısımların Krio-EM" kullanılarak veya CEMOVIS bir kesit bir yaklaşım ile elde edilebilirhızlı dondurma ve camsı buz numune yerleştirme ve bir kriyojenik sıcaklık 11, 12 EM bölümü altında incelenmesi ile. Onlar hala sağlam ve tam sulu iken Bu prosedür böylece dehidrasyon nedeniyle eserler ortadan kaldırarak 13 işlediğinde, numunelerin incelenmesi için izin verir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli ek harcamalar, çok düşük sıcaklıklarda, bu gözlem olanak sağlamak amacıyla, kriyo-ultramikrotom için ilave cihazlar, hem de standart EM ek aygıtları kapsamaktadır. Buna ek olarak, CEMOVIS yaklaşım antikorlar genellikle oda sıcaklığında inkübe edilmesi gerekir, çünkü teknikleri ile immün kullanımını engeller. Seçenek olarak ise, kriyo-koruyucu kimyasal immerged ve inci ise cryo sabit Numuneler çözülür sırasında dondurularak ikame yaklaşım kullanılarak immünohistokimyasal prosedürlere ultrastrüktürel analiz birleştirmek mümkündürtr Böyle Lowicryls gibi özel reçineler, gömülü. Post-gömme immunolabeling sonra böyle materyal 12 üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, dondurularak ikamesi ve cryo-sabitleme teknikleri zaman alıcıdır. Bunlar, ilave donanım takılmasını gerektirir ve düşük bir sıcaklıkta 14, 15 kullanımına rağmen, bir organik çözücü ve hücre mimarisini değiştirebilir kimyasal sabitleyici maruz kalması örnekleri gerektirir. Bu nedenle, özellikle akrolein LM ve EM DÜZEYİ, beyin dokusunun kimyasal sabitleme, her ikisi de tüm teknolojik ilerlemelere rağmen, EM 16 immünohistokimya birleştirmek için bir düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlayan bir yöntem olmaya devam etmektedir.
Son birkaç on yılda, birçok girişimde iyi doku korunmasını sağlayan aldehitlerin karışımı bulmak için yapılmıştır. 1960'lardan önce, EM için kabul edilebilir sonuçlar vermiştir sadece kimyasal sabitleyici ozmiyum tetroksit oldu. Bununla birlikte, ozmiyum tetroksit beyin gibi organları düzeltmek için damar sistemi aracılığıyla kullanımını engelleyen, son derece zehirli ve pahalıdır. Akrolein hücresel yapıların 17 EM, gözlem için uygun hayvan doku koruması için güvenilir bir yöntem olarak 1950'lerin sonlarında tanıtıldı. Bu daha derin doku nüfuz eder ve daldırma ile fiksasyonu için ve doku 17 minimum çekme sitoplazmik bileşenlerin iyi bir koruma sağlar, diğer aldehitler daha hızlı bir şekilde tepki verir. Bu tür enzimler ve diğer proteinleri 18 gibi moleküler bileşiklerin, canlı daha doğru bir lokalizasyonu ile, taze doku kullanıldığında Böyle bir özellik akrolein fiksasyon başka aldehitlerle üzerinde açık bir avantaj sağlar. Gerçekten de, bu etkin bir stabilitesine sahip olarak, Kurbağa ve kemirgenler de dahil olmak üzere pek çok türde, EM seviyesinde görselleştirme için fiksasyon kolay, verimli ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yıl boyunca doğrulanmıştırzes peptidler ve proteinler, antijenitesini muhafaza eden ve 16, 18, 19, 20, 21 tespit maddesi bir aldehit ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman nispeten sağlam ultrastrüktürel sağlar. Kemirgenlerde akrolein tespit için protokoller o zamandan beri standardize edilmiş ve EM 16, 22 için çift immunolabeling uygulamak, özellikle Pickel grup tarafından, yoğun kullandık. Birkaç grupları insan olmayan primat beyin dokusunda 23 akrolein fiksasyonunu kullandık. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, verimli EM 24 immunolabeling uyumlu insan olmayan primatlarda akrolein ile kimyasal fiksasyonunu açıklayan tek yayınlanmış protokol vardır.
Bu makalede, verimli kimyasal olarak uğultu düzeltmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlamaktırile immün ve iletim EM inceleme öncesi gömme birlikte, potansiyel olarak uzun süreli korunması için izin akrolein bir primat beyinler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, insan-olmayan primatlar ve EM örnek incelenmesi için uygun ön gömme immünohistokimya ile transkardiyak perfüzyon için güvenilir bir protokol mevcut. Örneğin CEMOVIS gibi tipik cryo-EM, beyin yapısı ile ilgili iyi bir koruma sağlar, ancak, aynı zamanda, immünohistokimya 12 kullanımını sınırlar. Kriyo-değiştirme ve Tokuyaso tekniği de dahil olmak üzere başka teknikler, immünohistokimya gömme sonrası sağlar, ancak bu teknikler, işlem sırasında gerekli ola…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Doğa Bilimleri ve (MP NSERC, 401848-2011) Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. MP Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) bir kariyer ödülünü aldı. LE FRQ-S (FRQ-S 14D 29441) bir doktora burs alıcı oldu. Biz teknik yardım için Marie-Josée Wallman teşekkür ederim.
Materials
| Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) | Fisher scientific | S374-500 | |
| Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) | EM Science | SX0710-1 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher scientific | S271-3 | |
| Hydroxymethyl aminomethane (THAM) | Fisher scientific | T370-500 | |
| HCl | EMD | HX0603-3 | 1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection. |
| NaOH | EMD | SX0590-1 | 5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection. |
| Acrolein (90%) | sigma | 110221 | 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection. |
| Autopsy venting table | Mopec | CE400 | |
| Electronic perfusion pump | cole parmer | masterflex L/S 7523-90 | |
| Needle (perfusion) | terumo | NN-1838R | 18G 1 1/2 |
| Needle | terumo | NN-2713R | 21G 1/2 |
| Ketamine | 20 mg/kg | ||
| Xylazine | 4 mg/kg | ||
| Acepromazine | 0.5 mg/kg | ||
| Scalpel | |||
| Scalpel blades | Feather lance | 201011 J9913 | No.22 for surgery and No. 11 for EM |
| Surgical scissors | |||
| Rongeurs | |||
| Vibratome | Leica | VT 1200S | Calibrate blade before each use, when the device allows it |
| Vibratome razor blade | Gillette | GIN 642107 | |
| Glycerol | Fisher scientific | G33-4 | 30% dilution |
| Ethylene glycol | Fisher scientific | E178-4 | 30% dilution |
| Sodium borohydride (NaBH4) | sigma | S-9125 | |
| Normal horse serum | Jackson immunoResearch Laboratories | 008-000-121 | 2% dilution |
| Cold-fish gelatin | Aurion | 900.033 | 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40% |
| Primary antibody, SERT | Santa Cruz biotechnology | SC-1458 | 1/500 dilution |
| Primary antibody, ChAT | Chemicon (Millipore) | AB144P | 1/25 dilution |
| Primary antibody, TH | ImmunoStar | 22941 | 1/1000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, goat | Vector laboratories | BA-9500 | 1/1000 dilution |
| Biotinylated secondary antibody, mouse | Vector laboratories | BA-2000 | 1/1000 dilution |
| Vectastain elite ABC kit | Vector laboratories | PK6100 | 8.8 µL/mL of A and B each |
| 3'3 diaminobenzidine (DAB) | Sigma | D5637 | 0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink. |
| Peroxide (H2O2) 30% | Fisher scientific | H-323 | 0,005% dilution |
| Osmium tetroxide (OsO4) | Electron microscopic science | 2% 19152 4% 19150 | Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection. |
| Durcupan water-repellent epoxy resin | sigma | A: M epoxy resin (44611) B: hardener 964 (44612) C: accelerator 960 (DY 060) (44613) D: plasticizer (44614) | Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste. |
| Alumium cups | Electron microscopic science | 70048-01 | |
| Ethanol | commercial alcohols | 1019C | Dilute in distilled water with appropriate concentration |
| Propylene oxide | Electron microscopic science | 20401 | Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood. |
| Non-coated medium glass slides | brain research laboratories | 3875-FR | Grease surface with mineral oil |
| Plastic film (Aclar embedding film) | Electron microscopic science | 50425-25 | Grease surface with mineral oil |
| Ultramicrotome | Leica UC7 | EM UC7 | |
| Diamond trimming tool (ultratrim) | Diatome | UT 1081 | Can use glass knife alternatively |
| Ultra 45° Diatome Diamond knife | Diatome | MC13437 | equipped with a boat |
| Xylenes | Fisher scientific | X5SK-4 | |
| 150-mesh copper grids | Electron microscopic science | G150-cu | |
| grid-box | Electron microscopic science | 71138 | Can store up to 100 grids |
| Sodium citrate | Anachemia | 81983 | |
| Lead nitrate | sigma | L-6258 | Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light. |
| Syringe | terumo | SS-05L | 5 mL |
| Syringe filter | corning | 431222 | 0.2 µm |
| Absorbing paper (bibulous paper) | Electron microscopic science | 70086-1 | |
| Parafilm | Laboratory film | PM-999 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 |
References
- Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
- Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
- Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
- Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
- Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
- Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
- Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
- Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
- Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
- Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
- Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
- Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
- Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
- Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
- Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
- Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
- Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
- Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
- King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
- Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
- Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
- Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
- Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
- Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
- Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
- Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
- Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
- Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
- Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
- Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
- Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
- Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
- Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
- Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
- Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
- Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
- Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 83-90 (2014).
- Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
- van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
- Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
- Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
- Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
- Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
- Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).
