Summary
De gezondheidsstatus van de long wordt weerspiegeld door het type en het aantal immuuncellen die aanwezig zijn in de bronchiolen van de long. We beschrijven een bronchoalveolaire lavage techniek die de isolatie en studie van niet-adherente cellen en oplosbare factoren uit het onderste luchtwegen van muizen mogelijk maakt.
Abstract
Bronchoalveolar Lavage (BAL) is een experimentele procedure die gebruikt wordt om de cel- en acellulaire inhoud van het longlumen ex vivo te onderzoeken om inzicht te krijgen in een lopende ziekte toestand.
Hier wordt een eenvoudige en efficiënte methode beschreven om BAL uit te voeren op muizenlonge zonder speciale gereedschappen of apparatuur. BAL-vloeistof wordt geïsoleerd door een katheter in de luchtpijp van terminale verdoofde muizen in te voeren, waardoor een zoutoplossing in de bronchiolen wordt ingebracht. De ingevoerde vloeistof wordt voorzichtig teruggetrokken om BAL-vloeistofherwinning te maximaliseren en de schuifkrachten te minimaliseren. Deze techniek maakt het mogelijk om de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen in de luchtwegen en BAL-vloeistof te behouden.
Talrijke technieken kunnen worden toegepast om verder inzicht te krijgen in de ziekte van de long. Hier is een veelgebruikte techniek voor het identificeren en opsomming van verschillende soorten immuuncellenBeschreven, waarbij stromingscytometrie gecombineerd wordt met een selectiepaneel van fluorescent gelabelde celoppervlakspecifieke markers. De BAL-procedure die hier wordt gepresenteerd, kan ook gebruikt worden om infectieuze stoffen, vloeibare bestanddelen of ingeasemde deeltjes in muizenlongen te analyseren.
Introduction
De luchtwegen stuiten op talrijke beledigingen, wat kan leiden tot ontstekingen, pathogeen invasie, of kwaadaardige transformatie. De epitheliale cellen die de long lumen lijn vormen een grote belemmering van het zoogdierlichaam. Samen met alveolaire macrofagen, te voorkomen dat zij bedreigingen voor het milieu van het verkrijgen van toegang tot de systemische systeem via de luchtwegen. Voorbeelden van dergelijke bedreigingen omvatten organische en anorganische chemicaliën, bacteriën en virussen. Op dezelfde manier kunnen specifieke inentingen of therapeutische interventies worden ontworpen om de longen te richten. In al deze gevallen, een uitgebreide analyse van de opgeroepen respons is belangrijk om te begrijpen, grijpen, of biologische processen die plaatsvinden binnen de luchtwegen te voorkomen.
Bronchoalveolaire lavage (BAL) is een waardevolle methode om dergelijke responsen te analyseren, omdat de resulterende monsters belangrijke informaties ontstekingsreacties immuunmechanismen bevatten en besmettelijke ziekteprogressieDat kan optreden in de pulmonale luchtwegen 1 , 2 . Door gebruik te maken van BAL, is het mogelijk om de infiltrerende cellen te bestuderen. Dit contrastt met verteerde longen, die een "vuiler" celpopulatie geven, met veel dode en kleverige cellen. BAL wordt uitgevoerd door een zoutoplossing in de terminale bronchiolen in te voeren en vervolgens deze oplossing te herstellen. De opgehaalde oplossing kan dan gebruikt worden om inwonende long en infiltrerende ontstekingscellen te kwantificeren en fenotypisch te analyseren. Deze methode wordt vaak toegepast voor het bestuderen van cellulaire instroom in ziektebeelden van de luchtwegen, zoals astma, chronische obstructieve longziekte (COPD) en infectieziekte modellen. Afgezien van de cellulaire samenstelling wordt ook de moleculaire samenstelling van de pulmonale luchtwegen weerspiegeld in de BAL vloeistof. Om dit te analyseren kan Enzyme-gekoppelde Immunosorbent Assay (ELISA), immunoblot, en de gelijktijdige analyse van meerdere cytokinen door een cytokine-kraalgroep wordenuitgevoerd om de aanwezigheid van cytokines en chemokines beoordelen.
BAL is een gevestigde methode om de influx van ontstekingscellen onderzoeken bij inflammatoire respiratoire aandoeningen diermodellen. De waarneming van een veranderde cellulaire influx (bijvoorbeeld verhoogde niveaus van lymfocyten, eosinofielen, of neutrofielen) kan leiden tot een beter inzicht in de ziekte en kan een objectieve parameter om de prestaties van een therapeutische interventie te kunnen beoordelen.
De nauwkeurige en reproduceerbare interpretatie van BAL cellulaire analyse vereist dat de BAL juist wordt uitgevoerd en dat de verzamelde vloeistof wordt behandeld en goed verwerkt. De term "bronchiale lavage" werd meer dan tachtig jaar geleden geïntroduceerd door Stitt 3. In 1961 Myrvik verkregen alveolaire macrofagen van de spoelvloeistof konijn longen 3. BAL is nu een veel gebruikte methode voor het analyseren en bewaken van de longen in het muismodel, maar deRe is nog geen rapport van een gestandaardiseerde BAL procedure in de wetenschappelijke literatuur 4 , 5 . Bovendien zijn er waarschijnlijk zoveel manieren om BAL uit te voeren, omdat er onderzoekslaboratoria zijn die de techniek 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 gebruiken. Het is belangrijk dat de gegevens die verkregen worden uit de BAL de hele muizenlong vertegenwoordigen, en niet alleen een deel van de long. Dit soort veranderingen compliceert de interpretatie en vergelijking van resultaten tussen verschillende proeven.
Hier wordt een basale, goedkope en reproduceerbare BAL-procedure beschreven die het mogelijk maakt de verzameling van de cellulaire en oplosbare fractie die aanwezig is in het luchtweglumen van de muis mogelijk te maken. Kortom, een katheter wordt in de blootgestelde luchtpijp geplaatstfa terminaal verdoofde muis. Een injectiespuit wordt verbonden met de katheter, en een gebufferde zoutoplossing die ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) wordt in de longen. De long lumen wordt bemonsterd door voorzichtig herhaaldelijk spoelen van de zoutoplossing met de zuiger. De negatieve druk die tijdens deze stap minimaal luchtwegcollaps voorkomen. Na verzameling dient de verkregen BAL verder verwerkt te noemen en identificeren van de cellen door flowcytometrie.
Protocol
Alle dierproeven beschreven in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale (Belgische wet 14/08/1986 en 22/12/2003, Koninklijk Besluit 06/04/2010) en Europese wetgeving (EU-richtlijnen 2010/63 / EU en 86 / 609 / EEG). Alle experimenten op muizen en alle dierlijke protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit Gent (vergunning nummers LA1400091 en EC2016-027).
1. Voorbereiding
- lavagevocht
- Bereid een gebalanceerde zoutoplossing met 100 uM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA).
LET OP: Voor het meten van proteïne niveaus in de BAL-vloeistof, is het raadzaam om proteaseremmers toe te voegen aan protease activiteit te voorkomen in de BAL-vloeistof.
- Bereid een gebalanceerde zoutoplossing met 100 uM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA).
- catheter
- Voeg een katheter door het met een 23 G naald in doorzichtige kunststof polyethyleen 21 G buis (binnendiameter: 0,58 mm, buitendiameter: 0,965 mm en een lengte: 0,5 cm). Premade catheters kunnen ook worden gebruikt.
- AnesthWDV
- Voorbereiding van een terminale verdoving, bij voorkeur een die ademhalingsarrest veroorzaakt (bijvoorbeeld een barbituraat zoals natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Het is aangeraden om ingespoten verdoving te gebruiken in plaats van ingeademde verdoving, aangezien ingeasemde verdoving invloed kan hebben op het BAL-vloeistofgehalte. CO 2 heeft bijvoorbeeld invloed op de pH van het bloed en derhalve op de herverdeling van verschillende verbindingen 12 .
- Voorbereiding van een terminale verdoving, bij voorkeur een die ademhalingsarrest veroorzaakt (bijvoorbeeld een barbituraat zoals natriumpentobarbital (> 100 mg / kg) oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Ammoniumchloride-kalium (ACK) rode bloedcellysisbuffer
- Bereid een ACK lysisbuffer op door 8,29 g NH4Cl en 1 g KHCO3 op te lossen in 1 liter H20 met 100 μM EDTA; Rode bloedcellysisbuffer kan ook bij een externe bron worden gekocht.
2. Uitvoering van de bronchoalveolaire lavage (BAL)
- Introductie van de katheter in de luchtpijp
- Euthanize de muis door intraperitoneale injectie van een dodelijke dosis van een kortwerkende barbituraat verdoving met behulp van een 26 G naald. Om de juiste dodelijke verdoving te bevestigen, knippert u de achterpoot van de muis met pincet om de voetreflex te controleren.
- Plaats het dier op zijn rug op een chirurgische plaat en maak de muis vast door de ledematen vast te spannen.
- Spuit 70% ethanol op de nek om te desinfecteren. Maak een snede in de nekvel bij de trachea met behulp van een scalpel.
- Open de huid om de speekselklieren bloot te stellen. Scheid de speekselklieren door middel van pincers om de sternohyoid spier bloot te leggen. Inciseer de spier rond de luchtpijp met behulp van pincers om de luchtpijp bloot te leggen.
- Plaats een katoenen draad onder de luchtpijp met behulp van handgrepen.
- Pijn het midden van de blootgestelde luchtpijp voorzichtig tussen twee kraakbeenringen met een 26 G-naald. Wees voorzichtig om de luchtpijp niet verder te beschadigen.
- Plaats de katheter ongeveer 0,5 cm in de luchtpijp. Zorg ervoor dat de catheter niet te ver naar beneden in de luchtpijp ingebracht, omdat dit kan leiden tot beschadiging van de longen structuur.
- Stabiliseren van de katheter door het binden van de trachea rond de katheter met de katoenen draad geplaatst in stap 2.1.5. Als de katheter niet voldoende is gebonden, kan de geïnjecteerde gebalanceerde zoutoplossing naar het bovenste deel van het ademhalingskanaal stromen in plaats van naar beneden in de longen.
- Verzamel de wasvloeistof
- Laad een 1 ml spuit met 1 ml steriele gebalanceerde zoutoplossing met 100 pM EDTA.
- Sluit de 1 mL spuit om de katheter en injecteer voorzichtig het zout / EDTA-oplossing in de longen.
- Zuig de oplossing zachtjes terwijl het masseren van de thorax van de muis. Indien de afgezogen vloeistof is niet zichtbaar in de injectiespuit voorzichtig een katheter iets verder omlaag of de luchtpijp.
- Verwijder de naald van de spuit en breng het teruggewonnen spoelvloeistof in een 15 ml buisje op ijs geplaatst. Normaal gesproken, 700-900 &# 181; L van BAL wordt hersteld uit 1 ml geïnjecteerde oplossing.
- Herhaal stap 2.2.1 - 2.2.4 nog twee keer.
OPMERKING: als het doel is om de niet-cellulaire inhoud te analyseren, wordt het aanbevolen om de samengevoegde monsters te concentreren wanneer er gevoeligheidsproblemen zijn.
3. Het verzamelen van de cellulaire en noncellulaire componenten van de BAL Fluid
- Centrifugeer de spoelvloeistof gedurende 7 minuten bij 400 xg en 4 ° C.
- Verzamel de supernatant en gebruik hem onmiddellijk voor verdere analyse ( bv. ELISA) of vries bij -80 ° C. Houd de celpelletje om de cellulaire instroom in de longen te analyseren.
- Resuspendeer de celpellet in 200 μl ACK-lyseringsbuffer.
OPMERKING: Deze stap zorgt voor de lysis van de erytrocyten terwijl de witte bloedcellen intact blijven. - Incubeer gedurende 2 minuten bij RT.
OPMERKING: Om de variatie die door rode cellysis wordt veroorzaakt te verminderen, moet deze stap langer dan 2 minuten worden uitgevoerd. Voeg 1 ml koude PBS toe om de ACK-lyseringsbuffer te verdunnen. - Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 400 xg en 4 ° C. Gooi de supernatant weg en verwijder de cellen opnieuw in een voldoende volume PBS voor stroomafwaartse analyse (zie hieronder).
OPMERKING: Het volume van de PBS hangt af van de downstream studie die wordt uitgevoerd.
4. Analyse van de verschillende celtypen in de BAL-vloeistof door flowcytometrie
OPMERKING: Eén mogelijkheid is de absolute en relatieve cellulaire samenstelling van het BAL-vloeistof te analyseren door middel van flowcytometrie. Het doel van deze krant is om de techniek van BAL uit te breiden. Flowcytometrie is eigenlijk een gespecialiseerde techniek. Het wordt aanbevolen om gespecialiseerde papieren te lezen over de flowcytometrie techniek 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Antilichamen gekoppeld aan een fluorofoor that erkennen oppervlakteantigenen (zie Tabel 1) specifiek voor een bepaald type (s) cellen worden gebruikt. Door een gating strategie, is het mogelijk om T-cellen, macrofagen, dendritische cellen, B-cellen, eosinofielen en neutrofielen te identificeren in de celfractie van de BAL.
| Antigeen | celtype |
| Cluster van differentiatie 3 (CD3) | Uitgedrukt op T-cellen |
| CD-merker 11c (CD11c) | Hoge expressie op de meeste dendritische cellen, maar ook op monocyten, macrofagen, neutrofielen, en een aantal B-cellen. |
| CD-merker 11b (CD11b) | Op het oppervlak van de vele leukocyten waaronder monocyten, neutrofielen, natural killer cellen, granulocyten en macrofagen. |
| SiglecF | EENLveolaire macrofagen en eosinofielen. |
| MHCII | Normaal gesproken alleen gevonden op antigeen presenterende cellen, zoals dendritische cellen, mononucleaire fagocyten en B-cellen. |
| CD19 | B-lymfocyt antigen |
| Ly-6G | Een marker voor monocyten, granulocyten en neutrofielen |
Tabel 1: Selectie van immuun cel oppervlak antigenen. Deze tabel bevat een lijst van oppervlakte epitopen die gebruikt worden om de verschillende celtypen te karakteriseren. Combinaties van meerdere markers zullen nodig zijn om een bepaald celtype betrouwbaar te definiëren.
| samples | ||||
| Buis | Antigeen-fluorofoor toegevoegd aan cellen Antibody stock concentratie (mg / mL) | Antilichaamverdunning | Totaal volume (μL) | |
| Vaste levensvatbaarheid kleurstof | 0.2 | 1/1000 | 50 | |
| CD11c | 0.2 | 1/800 | 50 | |
| SiglecF | 0.2 | 1/100 | 50 | |
| Monster X | MHCII | 0.2 | 1/200 | 50 |
| CD3 | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| CD19 | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| CD11b | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| Ly6G | 0.2 | 1/200 | 50 | |
| Spanningscontroles | ||||
| Buis | Antigeen-fluorofoor wordt toegevoegd aan cellen | Antilichaam voorraad concentratie (mg / ml) | antilichaamverdunning | Totaal volume (pl) |
| gekleurde cellen | / | / | / | 50 |
| Single gekleurde cellen | Fixeerbaar levensvatbaarheidkleurstof | 0.2 | 1/1000 | 50 |
| Single gekleurde cellen | CD11c | 0.2 | 1/800 | 50 |
| Single gekleurde cellen | SiglecF | 0.2 | 1/100 | 50 |
| Single gekleurde cellen | MHCII | 0.2 | 1/200 | 50 |
| Single gekleurde cellen | CD3 | 0.2 | 1/200 | 50 |
| Single gekleurde cellen | CD19 | 0.2 | 1/200 | 50 |
| Single gekleurde cellen | CD11b | 0.2 | 1/200 | 50 |
| Single gekleurde cellen | Ly6G | 0.2 | 1/200 | 50 |
| compensatie controles | ||||
| Buis | Antigeen-fluorofoor wordt toegevoegd aan korrels | Antilichaam voorraad concentratie (mg / ml) | antilichaamverdunning | Totaal volume (pl) |
| ongekleurd kralen | / | / | / | 200 |
| Single gekleurd kralen | CD11c | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkele gekleurde kralen | SiglecF | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkele gekleurde kralen | MHCII | 0.2 | 1/200 | 200 |
| Enkele gekleurde kralen | CD3 | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkele gekleurde kralen | CD19 | 0.2 | 1/2000 | 200 |
| Enkele gekleurde kralen | CD11b | 0.2 | 1/400 | 200 |
| Enkele gekleurde kralen | Ly6G | 0.2 | 1/200 | 200 |
Tabel 2. Lijst van Controles die bijgesloten moeten worden. Deze tabel toont alle noodzakelijke controles voor de nauwkeurige interpretatie van de verkregen resultaten.
- Cell surface kleuring
OPMERKING: Het is impoRtant om alle kritische controles voor de flow cytometry analyse in te vullen. Er zijn drie sets buizen nodig (zie tabel 2 ): (1) buizen die de monsters bevatten; (2) buizen met BAL cellen voor elk antilichaam-fluorofoor om enkele vlekken te maken; Dit zorgt voor de bepaling van de spanningen voor elk kanaal op de flow cytometer; En (3) buizen met kralen voor elk antilichaam-fluorofoor om enkele vlekken te maken; Dit is de compensatiematrix te bepalen.- Maak een mengsel van de antilichamen en Fc-blok (anti-CD16 / CD32) in PBS bij de juiste verdunningen (zie tabel 2 ). Het is noodzakelijk om de optimale werkverdunning voor elk antilichaam voorafgaand aan het experiment te bepalen.
- Resuspendeer de cellen in 50 μl van de antilichamenmix voor het monster en voeg 50 μl van het geschikt verdund antilichaam toe aan de kritische controles.
OPMERKING: De kleuring kan uitgevoerd worden in een 96-putjes, u-vormige plaat. Dit maakt het mogelijk om het vlekvolume a gemakkelijk te verminderenEn bedragen significante hoeveelheden monsters. - Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 ° C.
- Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 400 xg en 4 ° C. Gooi de supernatant weg.
- Zet de cellen opnieuw op in PBS tot een eindvolume van 200 μl.
OPMERKING: Dit laatste volume hangt af van het minimale volume dat de flow cytometer kan gebruiken. Dit kan iets verschillen tussen machines. Daarnaast hangt het leesvolume af van het aantal cellen en / of de tijd die het monster zal nemen om in de flow cytometer te rennen. - Gebruik de monsters en controles voor flowcytometrische analyse.
OPMERKING: Om het absolute celnummer van de verschillende celpopulaties te bepalen, moeten de kralen worden toegevoegd. Voeg hetzelfde aantal kralen (± 25.000 kralen) toe aan elk monster net voor meting. Door gebruik te maken van voor- en zijkantverdeling, kunnen kralen worden geïdentificeerd door middel van flowcytometrie (zie Figuur 1 ). Vervolgens kan het absolute aantal cellen in het monster worden berekend door het vergelijken van thE verhouding van kraal gebeurtenissen naar cel gebeurtenissen. De volgende formule kan gebruikt worden:
- Flow cytometrische analyse
OPMERKING: De flowcytometrische analyse moet onmiddellijk na de voltooiing van het kleurprotocol worden uitgevoerd. Een flow cytometer met geschikte lasers en filters voor signaal detectie moet worden gebruikt. Tabel 3 geeft een overzicht van de lasers en filters die nodig zijn voor de studie beschreven in dit manuscript. Voor meer informatie over flowcytometrische analyse, zie Adan et al. 18 .- Stel de primaire poorten op basis van de voorwaartse en de zijspreiding, met uitzondering van puin en dubbeltjes (zie figuur 1 ).
- Pas de spanning en de compensatie voor spectrale overlap aan met behulp van de enkelkleurige cellen en kralen.
OPMERKING: Deze instellingen zijn verschillend voor elke flow cytometer en moeten vóór elk experiment worden gecontroleerd. Fof corrigeren stroomanalyse de forward- en zijdelingse verstrooiing spanningen kritisch. Een juiste voorwaartse en zijwaartse verstrooiing kan helpen bij de identificatie en bevestiging van de identiteit van de geanalyseerde cellen. Om deze spanningen te bepalen, dient een ongekleurde monster eerst worden uitgevoerd. - Opgericht fluorescentie poorten van het oppervlak antigeen (zie figuur 1) en de monsters te analyseren.
| Type laser | filter setup | |
| 505 LP | 525/50 | |
| Blauw (488 nm) | 550 LP | 575/26 |
| 100 mW | 670 LP | 685/35 |
| 750 LP | 780/60 | |
| violet 405 nm | 450/50 | |
| 100 mW | ||
| Rood 633 nm | 660/20 | |
| 70 mW | 750 LP | 780/60 |
Tabel 3: Overzicht van de Lasers en Filters van de Flow Cytometer gebruikt in deze studie.
Representative Results
Na het uitvoeren BAL met 3 x 1 ml gebufferde zoutoplossing, zou een volume tussen 2 en 3 mL worden teruggewonnen. Dit BAS vloeistof kan verder worden geanalyseerd om de cellulaire en niet-cellulaire inhoud te karakteriseren. Om de aanwezigheid van cytokinen en chemokinen, 19 ELISA, immunoblot 20 en de gelijktijdige analyse van meerdere cytokinen door een cytokine bead matrix 21 onderzoeken kunnen worden uitgevoerd. Bovendien kan het albumine en totale eiwitgehalte van het fluïdum worden bepaald 22.
Als voorbeeld, dit manuscript beschrijft hoe de cellulaire inhoud van de BAL-vloeistof met flowcytometrie geanalyseerd. De geanalyseerde BAS vloeistof werd verzameld van vrouwelijke Balb / cAnNCrl muizen (leeftijd: 7 weken) 24 uur na intratracheaal gedruppeld met lipopolysaccharide. De volgende antilichamen, gekoppeld aan een fluorofoor, wEre is gebruikt om de verschillende celsoorten te identificeren: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g en CD11b (zie tabel 1 en de tabel van materialen ). De fixeerbare levensvatbaarheidsverfstof werd ook gebruikt. Door gebruik te maken van een gate strategie gebaseerd op de differentiële expressie van antigenen op de oppervlakken van de verschillende celpopulaties ( Figuur 1 ), was het mogelijk macrofagen, dendritische cellen, B-cellen, T-cellen, neutrofielen en eosinofielen te identificeren.
In de eerste plaats werden puin en doubletten uitgezet op basis van voor- en zijverspreidingsparameters. Een levensvatbaarheid kleurstof faciliteerde gating op de levende cellen. Vervolgens werden CD11c hoge cellen en CD11c lage cellen geïdentificeerd. In de CD11c hoge populatie werden macrofagen en dendritische cellen geïdentificeerd op basis van respectievelijk MHCII en SiglecF expressie. In de CD11c lage populatie werden T cellen en B-cellen geïdentificeerd op basis van respectievelijk CD3ε en CD19 expressie. In thE resterende celpopulatie, neutrofielen en eosinofielen werden geïdentificeerd op basis van respectievelijk de CD11b- en Ly-6G-marker expressie.
Tellen kralen werden toegevoegd om de absolute celtallen van de verschillende celpopulaties te bepalen door de verhouding van kraalgebeurtenissen met celgebeurtenissen 23 te vergelijken. Deze tellen kralen werden geïdentificeerd op basis van hun voor- en zijverspreidingseigenschappen ( Figuur 1 ). Tabel 4 geeft een overzicht van de absolute celtallen van de verschillende celpopulaties in het BAL-fluïdum van een naïeve muis en een muis die gedurende 24 uur gestimuleerd werd met 5 μg lipopolysaccharide.
Figuur 1: Gatingstrategie voor de flowcytometrische detectie van macrofagen, dendritische cellen, T-cellen, B-cellen, neutrofielen en eosinofielen iN BAL Fluid. BAL-cellen werden geïsoleerd onder toepassing van het beschreven BAL-protocol. Cellen werden geïsoleerd van muizen 24 uur na intratracheale instillatie van lipopolysaccharide. Aantal kralen en cellen werden geïdentificeerd op basis van voor- en zijverstrooiingseigenschappen. In de celpoort werden afzonderlijke cellen geïdentificeerd met behulp van voorwaartse en zijspreiding. In deze laatste populatie werden cellen die in leven waren geïdentificeerd. CD11c hoge cellen en CD11c lage cellen werden vervolgens geïdentificeerd. In de CD11c hoge populatie werden macrofagen en dendritische cellen geïdentificeerd op basis van respectievelijk MHCII en SiglecF expressie. In de CD11c lage populatie werden T cellen en B-cellen geïdentificeerd op basis van respectievelijk CD3ε en CD19 expressie. In de overgebleven celpopulatie werden neutrofielen en eosinofielen geïdentificeerd op basis van respectievelijk CD11b en Ly-6G expressie. Klik hier om een te bekijkenGrotere versie van deze figuur.
| Celpopulatie | Absoluut aantal cellen in naïeve muizen | Absolute aantal cellen in LPS gestimuleerde muizen |
| macrofagen | 79.612 | 25.439 |
| dendritische cellen | 495 | 671 |
| T-cellen | 45.271 | 28.089 |
| B-cellen | 4164 | 2926 |
| neutrofielen | 632 | 566.716 |
| eosinofielen | 3483 | 4332 |
Tabel 4: Vertegenwoordigtieve resultaten van flowcytometrie analyse over de BAL vloeistof van naïeve en LPS-gestimuleerde muizen.
Discussion
BAL is een nuttige techniek om cytologische en biochemische informatie te verkrijgen in reactie op infecties of medicijnen. Aanvankelijk werd BAL gebruikt om de overmatige mucusproductie te beheren bij menselijke patiënten die lijden aan fosgeen toxiciteit 3 . Tegenwoordig wordt de techniek gebruikt bij mensen om longpatogenese, diagnose en therapeutisch beheer van ziekten 3 , 24 te onderzoeken. Bij laboratoriumdieren wordt BAL meestal gebruikt om ontstekingsreacties, immuunmechanismen en infectieuze ziekteprocessen te controleren die zich voordoen in de longwegen 1 , 2 .
Om het ontstekingscellulaire patroon in de ademhalingsziekte modellen te bestuderen, moet BAL gevolgd worden door absolute en differentiële celtelling. Naast het absolute celnummer zijn ook de relatieve cijfers van belang. Bijvoorbeeld, reparatie en kankermodellen tonen vEry klein of geen BAL cel telling stijgt. In dit model is de beoordeling van de cellulaire samenstelling bruikbaar. Door celkleuring gecombineerd met lichtmicroscopie te gebruiken, kunnen verschillende celsoorten, zoals eosinofielen, neutrofielen, macrofagen en lymfocyten, worden geïdentificeerd op basis van morfologie 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Flowcytometrie kan worden gebruikt voor specifieke evaluaties, zoals het identificeren van verschillende T-cel fenotypes 7 , 31 . Naast de identificatie van de verschillende infiltrerende celpopulaties kan de niet-cellulaire samenstelling van de long onderzocht worden met BAL. Methoden zoals ELISA, immunoblot, cytokine kraalmatrix, immunohistochemie en kwantitatieve polymerase kettingreactie worden uitgevoerd op BAL-vloeistof om cytokinen te bepalen, groeiFactoren en andere ontstekingscomponenten. Om longschade te bepalen, kunnen de totale eiwit- en lactaatdehydrogenase-niveaus in het BAL-vloeistof ook 32 , 33 gemeten worden.
Met de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen zal de genomische en proteomische karakterisering van BAL componenten in de nabije toekomst mogelijk zijn. De combinatie van uitbreiding van de computergestuurdheid en de doordruktechnologieën met hoge doorvoer, maakt het mogelijk specifieke genuitdrukkingsprofielen voor verschillende ziektetoestanden te definiëren. Uitvoering van deze technieken op BAL-vloeistof kan gen- en eiwituitdrukkingspatronen verschaffen om de belangrijke moleculen die betrokken zijn bij de verschillende fasen van longziekten te identificeren.
De belangrijkste beperking van de gegevens verkregen uit BAL-vloeistof is het gebrek aan vergelijkbaarheid tussen verschillende onderzoeksproeven 3 , 9 . Er is een hoge mate vanVariabiliteit in de spoeltechniek en de daaropvolgende verwerking van BAL-vloeistof. Om elk BAL-proef te kunnen vergelijken, is het nodig om het type ingevoerde vloeibare vloeistof, de plaats van instillatie te standaardiseren en de fractie die moet worden geanalyseerd voor cellulaire en niet-cellulaire samenstelling. Er zijn significante verschillen in het aantal lavagefracties tussen verschillende proeven, variërend van 1 tot 14 keer 34 , 35 , 36 . Dit verschil kan invloed hebben op de geschatte totale cijfers in de longen. Het is belangrijk om te weten welke BAL-vloeistoffractie de meerderheid van de cellen bevat. Song et al. Toonde aan dat ongeveer 70% van het totale aantal cellen in fracties 1 tot en met 3 was opgehaald. Andere rapporten hebben echter voorgesteld dat de tweede lavage meer cellen bevat dan de eerste 37 , 38
De noncellulaire samenstelling van het BAL-vloeistof bevat waardevolle informatie over de gezondheidsstatus van de long 33 , 39 , 40 . Variaties in de verdunning van het BAL-vloeistof dragen bij aan het verschil in de kwantificering van de oplosbare fractie en bijgevolg tot verschillen in de resultaten tussen proeven. Song et al. Vergeleken het eiwit- en lactaatdehydrogenasevlak van elke lavagefractie en concludeerde dat de eerste lavagefractie twee tot drie keer meer dan de tweede fractie was.
Om een representatief BAL-monster te halen voor analyse, zijn enkele technische overwegingen van cruciaal belang. Een van hen is het uitvoeren van een goede verdoving. Het is heel belangrijk om de voetref te controlerenLex van de muis om de terminale sedatie te waarborgen. Dit is niet alleen belangrijk om ethische redenen, maar ook omdat het moeilijk is om de katheter in de juiste positie te plaatsen en te bewaren als de muis niet goed verdoofd is.
Een tweede belangrijke technische overweging is de positie van de katheter in de luchtpijp. Wanneer de katheter te diep wordt ingebracht, kan het de longstructuur beschadigen. Het distale uiteinde van de katheter moet de longen niet bereiken tijdens de BAL procedure. De katheter moet ook gestabiliseerd worden en met een katoenen draad afgesloten worden. Als de katheter niet gestabiliseerd is, kan de geïnjecteerde zoutoplossing naar boven in de neusholte stromen in plaats van naar de longen. Tijdens injectie en aspiratie van de zoutoplossing is het belangrijk om de katheter vast te houden.
De gegevens verkregen uit het BAL-vloeistof dienen de hele muizen long te vertegenwoordigen. Daarom is het belangrijk om een voldoende volume zoutoplossing buffer ( dwz3 ml, verdeeld in 3 porties van 1 ml elk). Er is geen lineaire relatie tussen de celopbrengst en de BAL-vloeistofopbrengst. Het is belangrijk om de oplossing voorzichtig te verzamelen terwijl u de thorax van de muis masseert. Als de schuifkrachten te sterk zijn, kan de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen in de luchtwegen en BAL-vloeistof worden gecompromitteerd. Als de gevulde vloeistof niet in de spuit is zichtbaar, beweeg de katheter voorzichtig of hoger in de luchtpijp.
Bijzondere kennisgeving moet gegeven worden aan specifieke aspecten van BAL verwerking en analyse. Dit zal de informatie die uit BAL-samples wordt behouden, maximaliseren. Na BAL zijn de cellen in een nutriëntenarm zoutzuurmedium. Het is daarom heel belangrijk om de monsters binnen 1 uur na BAL-monsterneming te verwerken. Indien langdurige opslag nodig is, is het gebruik van een voedingsmiddel aangevuld medium nodig.
Om de levensvatbaarheid van de cel te behouden, vermijd buizen die celadhesie aan het oppervlak bevorderen. Vermijd ceNtrifugatie van cel suspensies bij snelheden die waarschijnlijk de cellulaire integriteit in gevaar brengen of om eenvormige resuspensie van de opgehaalde BAL-cellen te voorkomen. BAL-vloeistof bevattende cellen moeten gedurende 7 minuten bij 400 xg en 4 ° C gecentrifugeerd worden. Het is belangrijk in gedachten te houden dat cel suspensies tijdens de verwerking bij 4 ° C gehouden moeten worden.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
LVH is een onderzoeksassistent aan het Departement Biomedische Moleculaire Biologie van de Universiteit Gent. ERJ wordt ondersteund door UniVacFlu, subsidie nummer 607690. KR wordt ondersteund door EC-FP7 project FLUNIVAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-129 | |
| ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6511 | irritating |
| 23 G x 1 1/4 needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | size: 0.60 x 30 mm |
| 26 G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | size: 0.45 x 12 mm |
| plastic tubing | BD medical technology | 427411 | Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023") O.D. 0.965 mm (0.38") 30.5 m (100') |
| sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | PBS without Ca2+ Mg2+ or phenol red; sterile filtered |
| 1 mL syringes | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | nonpyrogenic and nontoxic |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 | |
| centrifuge tube 50 mL | TH.Geyer | 7696705 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| centrifuge tube 15 mL | TH.Geyer | 7696702 | Free from Rnase/Dnase/endotoxin |
| microcentrifuge tube 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 0030 120.094 | polypropylene |
| Microcentrifuge | Sigma-Aldrich | 5415R | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Lonza | 10-548E | sterile-filtered |
| live/dead - efluor 506 | ebioscience | 65-0866-18 | fixable viability dye |
| CD11c-PE-cy7 | eBiosciences | 25-0114-81 | |
| SiglecF-PE | BD Pharmingen | 552126 | |
| MHCII-APCefluor780 | Biolegend | 107628 | |
| CD3-PE-cy5 | VWR | 55-0031-U100 | |
| CD19-PE-cy5 | eBiosciences | 15-0193-83 | |
| CD11b-V450 | BD Pharmingen | 560455 | |
| Ly6G-AF700 | Biolegend | 127621 | |
| Absolute Counting Beads | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| anti-CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| 96-well 340 µl storage plate plate | Falcon | 353263 | V-bottom, natural polypropylene |
| flow cytometer | BD Biosciences | ||
| catheter | BD Biosciences | 393202 |
References
- Stankunas, K., et al. Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).
- Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).
- Gee, J. B., Fick, R. B.
- Tornling, G., et al. Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz. Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material. Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).
- Morris, A., et al. Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection. Microbiome. 4 (1), 38 (2016).
- Naessens, T., et al. GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation. J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).
- Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease. Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).
- Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference. Chest. 90 (1), 122-131 (1986).
- Baughman, R. P.
- Singletary, M. L., et al. Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).
- Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents. Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
- Rubio-Navarro, A., et al. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J Vis Exp. (116), (2016).
- Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), (2011).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. (82), e51105 (2013).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
- Database, J. S. E. The ELISA method. J Vis Exp. , (2016).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting. J Vis Exp. (58), (2011).
- Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).
- Seliger, C., et al. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).
- Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease. Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).
- Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).
- Delayre-Orthez, C., et al. PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse. Respir Res. 6, 91 (2005).
- Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse. Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).
- Hachet-Haas, M., et al. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).
- Ble, F. X., et al. Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice. Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).
- Ble, F. X., et al. Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging. Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).
- Reber, L. L., et al. A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).
- Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).
- Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage. Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).
- Forget, G., et al. An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances. Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).
- Sung, J. H., et al. Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats. Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).
- Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung. Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).
- Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions. Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).
- Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis. Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).
- Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats. Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).
- Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects. J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).
