Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Summary

Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.

Abstract

Antilichaam-geconjugeerde (ACs) bewerkt met virus afkomstige peptiden zijn een potentieel krachtig klasse van tumor cel levering agenten voor moleculaire laadvermogens gebruikt in de behandeling van kanker en imaging als gevolg van verhoogde cellulaire accumulatie over huidige ACs. Tijdens de vroege AC in vitro zijn ontwikkeling, fluorescentie technieken en radioimmunoanalyses voldoende voor het bepalen van de intracellulaire lokalisatie, accumulatie efficiëntie en target cel specificiteit. Op dit moment is er geen consensus over gestandaardiseerde methoden voor het voorbereiden van cellen voor de evaluatie van AC intracellulaire accumulatie en lokalisatie. De eerste testen van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden is essentieel vooral als er meerdere kandidaten zijn aangelegd. Bepalen van intracellulaire accumulatie door fluorescentie kan worden beïnvloed door het signaal van de achtergrond van de ACs aan het celoppervlak en bemoeilijken de interpretatie van accumulatie. Voor radioimmunoanalyses, meestal behandelde cellen zijn gespreide en de radioactiviteit in verschillende cel compartimenten gemeten. Echter lysis van de cel varieert van cel naar cel en vaak nucleaire en cytoplasmatische compartimenten zijn niet afdoende geïsoleerd. Deze kan misleidende gegevens over de eigenschappen van de levering van de lading produceren. De intraveneuze injectie van radiolabeled virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs in tumor rekening houdend met muizen gevolgd door radionuclide imaging is een krachtige methode voor het bepalen van de tumor gericht en lading levering eigenschappen in de in-vivo -fase van ontwikkeling. Echter dit is een relatief recente vooruitgang en enkele groepen virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs op deze manier hebben geëvalueerd. We beschrijven de verwerking van behandelde cellen om nauwkeuriger virus afkomstige peptide gemodificeerde AC accumulatie bij het gebruik van de confocal microscopie en radioimmunoanalyses. Specifiek, een methode voor trypsinizing cellen verwijderen celoppervlak gebonden ACs. We bieden ook een methode voor het verbeteren van de cellulaire fractionering. Ten slotte, dit protocol voorziet een in vivo -methode met behulp van positron emissie tomografie (PET) evaluatie van de eerste tumor gericht op onroerend goed in tumor-dragende muizen. We gebruiken de isotoop ⁶⁴Cu (t-_1/2 = 12,7 h) als de payload van een voorbeeld in dit protocol.

Introduction

Antilichaam-geconjugeerde (ACs) zijn biofarmaceutica die zijn rijpen in een transformatieve klasse effectieve geneesmiddelen voor de verbetering van behandelingen van kanker en voor het opsporen van tumoren. Samengesteld uit een monoklonaal antilichaam (mAb) geconjugeerd met moleculaire payloads zoals radio-isotopen, kleine moleculen en biologische toxines, ACs kunnen leveren deze codering van de payloads tot kankercellen met uitgelezen doelwit antigeen affiniteit en specificiteit. Dus ACs hebben het potentieel om aanzienlijk verminderen van niet-specifieke toxiciteit en lading activiteit op de site van de tumor te verhogen. Therapeutisch, zijn ACs vervoer van cytotoxische kleine moleculen (meestal genoemd antilichaam-drug conjugaten) goedgekeurd voor de behandeling van patiënten met borstkanker en Hodgkin lymfoom die hebben gefaald conventionele behandelingen ^{1, 2}. Daarnaast ACs vervoeren radioactieve isotopen (kortweg radioimmunoconjugaten) zijn ook in ontwikkeling. Een AC vervoeren een isotoop voor imaging is goedgekeurd voor het identificeren van prostaatkanker uitzaaiing ³. Met veel meer therapeutische ACs ingediend voor goedkeuring ⁴, is optimisme voor de toekomst van de ACs om kanker zorg ⁵hoog.

Echter bij het afleveren van chemotherapeutica of radio-isotopen, ACs ondervindt bij het effectief accumuleren deze codering van de payloads binnen doelcellen. Dit aspect aanzienlijk bijdraagt in veel gevallen in het onvermogen van de ACs om langdurige ziektevrije overleving of hoog contrast tumor imaging ^6,7. In het algemeen, zodra ACs binden hun doel-antigeen zijn ze geïnternaliseerd via een proces dat bekend staat als receptor-gemedieerde endocytose. De ACs zijn vervolgens binnen de Endosomen in de val gelokt en verhandeld aan lysosomen voor afbraak en payload vrijgeven ⁸. Het intracellulaire mensenhandel proces vormt uitdagingen voor ACs aan het bereiken van een hoog laadvermogen specificiteit en werkzaamheid tegen kanker van de doelcellen. Bijvoorbeeld, veel antigenen zoals Her2 (doel voor therapeutische AC Trastuzumab-emtansine) tot 85% van de gebonden antilichamen in de eerste 30 min ⁹kunt recyclen. Bovendien, zodra aantasting optreedt, vrijgegeven chemotherapeutica en radio-isotopen kunnen worden actief geëxporteerd door de verhoogde expressie en/of activiteit van membraan geassocieerde vervoer eiwitten ^10,11. Lysosoom afbraak belemmert ook de levering van nieuwe biologische payloads zoals therapeutische enzymen en oligonucleotides die kunnen worden gedeactiveerd, ^12,,¹³. Kortom, is de kankercel zeer effectief bij intrekking van de nodige intracellulaire accumulatie van nettoladingen geleverd door ACs.

Dit protocol beschrijft hoe de uitvoering van het concept van het ACs-gekoppeld aan virus afkomstige peptides, speciaal voor endosome entrapment ontsnappen en lokaliseren naar de celkern. Met dergelijke verfijning te manipuleren cel hostsystemen, is het niet verwonderlijk dat de ontwikkeling van het virus afkomstige eiwitten en peptiden als potentiële biofarmaceutica lang heeft zijn ingebakken in therapeutisch onderzoek ¹⁴. Voor miljoenen jaren zijn virussen geëvolueerd om te verwerven van een uitzonderlijke collectie van eiwitten kunnen profiteren van normale fysiologische zoogdieren cel systemen om effectief gastheer cellen. Voor virussen die zijn geïnternaliseerd via receptor gemedieerde endocytose, zijn ze ook uitgedaagd met ontsnappen aan het lysosoom handel waar de aanval van een gelokaliseerde concentratie van proteasen kan problematisch zijn voor overleving. Een goed gekarakteriseerd virale afkomstige peptide gebruikt in drug levering voor het ontsnappen van endosome entrapment is het humaan immunodeficiëntie virus transactivator van transcriptie (Tat) eiwit ¹⁵. Tat vermag endosome entrapment ontsnappen door het aftasten van lage-pH op welk punt eiwit conformationele wijzigingen optreden waardoor Tat als u wilt invoegen zich in en verstoren de membraan endosomal ¹⁶. Dit resulteert in Tat-nettolading geconjugeerde kundig voor vlaag van het cytoplasma. Het tweede element van de virale manipulatie gerelateerde bij dit protocol is de aanpak gebruikt voor therapeutische genen en drugs naar de kern ¹⁷. Virussen zijn geëvolueerd om te manipuleren met succes host cel machines voor vordert langs het kernmembraan door door de nucleaire porie complexe (NPC). Cellulaire macromoleculen bevatten (of binding aan eiwitten die bevatten) nucleaire localisatie signalen (NLSs) nodig voor bindende tot nucleaire transport eiwitten (bv karyopherins α en β), waarmee de vereiste bewegingen door de NPC. Virussen hebben eiwitten bevatten NLS-sequenties die hen voorzien van de mogelijkheid om gebruik te maken van host cel vervoer eiwitten voor pendelen in de nucleus ¹⁸ontwikkeld.

Talrijke ACs eerder matiemaatschappij met Tat – en NLS-afgeleide peptiden en getest voor hun vermogen om te accumuleren binnen kankercellen en voor het targeten van tumoren ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30} (tabel 1). Studies leveren van cytotoxische payloads hebben aangetoond dat ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden kunnen aanzienlijk verhoging van cellulaire accumulatie, cytotoxiciteit en tumor doden over ongewijzigde ACs ^22,26. Een gemeenschappelijk kenmerk voor deze nieuwe klasse van het Keuzeaxioma is hun bouw. Doorgaans bevatten peptiden een terminal cysteïne bieden een gratis sulfaatzuurstof groep. MAbs zijn eerste reageerde met een noncleavable bifunctionele crosslinker met N– hydroxysuccinimide (NHS) en maleimide groepen op tegenovergestelde uiteinden. De NHS esters reageren met primaire amines op de mAb aan amide-bindingen. De gereageerde mAb met gratis maleimide groepen is het vervolgens reageerde met de sulfaatzuurstof groepen op de peptiden te vormen van een thio-ester-binding en dus het koppelen van de peptide en mAb. Hoewel homobifunctional crosslinkers geweest gebruikte ²⁸, heterobifunctional crosslinker meer in het algemeen worden gebruikt in de bouw van virus-afgeleide peptide-ACs ^{22,23,26, 31,}–³². Dit protocol gebruikt met name de crosslinker-sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC) voor zijn gebruiksgemak en omdat het wordt gebruikt in de goedgekeurde antilichaam-drug geconjugeerde Trastuzumab-emtansine en in veel virus-afgeleide peptide-ACs ^{8,22,23,26,31,32}. Polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium dodecyl sulfaat is de primaire methode voor het aanvankelijk bepaling vervoeging rendement en semi-quantifying hetaantal peptiden per mAb. Confocale microscopie met behulp van een fluorescently-gelabeld secundair antilichaam specifiek voor de mAb is meestal de methode voor het aanvankelijk uitrekenen intracellulaire distributie eigenschappen van peptide gemodificeerde ACs virus-afgeleide. Tot nu toe zijn de radio-isotopen de primaire payloads geleverd door virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs. Radio-isotopen zijn voordelig omdat radioactiviteit in cellen wordt gemakkelijk gekwantificeerd door gamma tellen. Daarnaast ACs die zijn vertaald in muismodellen van menselijke kanker onderzoekers voorzien de mogelijkheid om de tumor gericht op met behulp van moleculaire beeldvorming modaliteiten zoals single photon emission berekende tomografie en positron emissie tomografie (PET) ^{23 , 32 , 33}. In het algemeen, de constructie en validatie testmethoden voornamelijk gebruikt door onderzoekers bieden een zeer goede beoordeling van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden tijdens het aanvankelijke ontwikkelingsstadium effectief invoeren en leveren de lading binnen doelcellen en voor doel tumoren.

Tat – en NLS-gemodificeerde ACs hebben verlichte sleutelgebieden voor verdere verbetering van de nettolading levering binnen cellen van kanker en tumoren. Met betrekking tot de NLS gemodificeerde ACs kunnen de efficiëntie van intracellulaire accumulatie bescheiden ^23,31,34. Inefficiënte intracellulaire accumulatie wordt veroorzaakt door voortdurende endosomal entrapment. In vivo tumor targeting kan ook worden verminderd met beide Tat en NLS-gemodificeerde ACs. De actieve sequenties van Tat en NLS bevatten verschillende positief geladen residuen. Wanneer gekoppeld aan mAbs, kunnen de algemene kationische last aanzienlijk verhoogde ³⁵. Dientengevolge hebben de Tat – en NLS-gemodificeerde ACs verhoogd van opname in de gezonde weefsels en snelle bloed klaring verhoogd.

Onze fractie ontwikkeld een samengestelde stof bestaande uit cholzuur en gekoppeld aan NLS (ChAcNLS; Figuur 1). ChAcNLS gemodificeerde ACs kunnen verhogen van intracellulaire accumulatie van radio-isotopen geleverde en tumor gericht op t.o.v. NLS gemodificeerde en traditionele ACs ^33,34te verbeteren. Het mechanisme is erachter cholzuur en is geïnspireerd door de mogelijkheid van select nonenveloped virussen die niet op membraan fusion vertrouwen gebruiken cholzuur en om te activeren endosome ontsnappen door de vorming van ceramide. Varkens darmen virus werft bijvoorbeeld cholzuur en dat activeert sphingomyelinase, die de hydrolyse van sphingomyelinase in ceramide ^36,37,38katalyseert. Dit endosomal membraan destabiliseert en zorgt voor virus ontsnappen. Cholzuur en is dus een ander virus afkomstige onderdeel dat perfect past bij NLS.

Als dit veld beweegt naar voren en toekomstige optreden vooruitgang in lading levering per ACs bewerkt met virus afkomstige peptides, is het een geschikt moment om visuele demonstraties van hun biochemische en functionele kenmerken tijdens de initiële ontwikkeling. Hier beschrijven we onze protocol voor de initiële beoordeling van virus-afgeleide peptide gemodificeerde ACs voor de efficiënte maar eenvoudige bepaling van intracellulaire accumulatie en tumor gericht op tijdens de vroege fase ontwikkeling. Als modelsystemen voorbeeld gebruiken we de verkrijgbare mAbs 7G 3 en de A14. Procedure 1 beschrijft het gebruik van SDS-pagina als een methode die het mogelijk voor besluiten van de ‘ go/no go’ voor gebouwd ACs maakt. Procedure 2 beschrijft een methode met behulp van trypsinebehandeling waardoor verbeterde visualisatie van AC intracellulaire verspreiding en accumulatie. Procedure 3 beschrijft een methode voor verbeterde intracellulaire fractionering nauwkeurig bepalen nucleaire localisatie. In deze procedure we gebruik maken van de nettolading ⁶⁴Cu (t-_1/2 = 12,7 h) want het is kwetsbaar voor cellulaire efflux en een positron emitter ¹⁰is. Dus, de Procedure 4 beschrijft in vivo tumor gericht op karakterisering door PET imaging te visualiseren van opname van de tumor ten opzichte van de achtergrond (dat wil zeggen nontarget gezonde weefsels) en te bepalen of het voorbeeld AC kan specifiek en effectief doel de tumoren. Deze methoden zijn voldoende voor onderzoekers ontwikkelen ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden te identificeren van kandidaten voor verdere vooruitgang.

Protocol

De in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurde protocol en onder de ethische richtsnoeren van de ethische commissie van Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke voor dier experimenten. 1. antilichaam Peptide Woordherkomst en-opbouw Opmerking: ChAcNLS kan gesynthetiseerd worden bij elke commerciële peptide fabrikant of universiteit-aangesloten peptide synthese serviceplatform. De synthese van ChAcNLS kan worden gevonden in …

Representative Results

Voor Procedure 1, de constructie van 7G 3 bewerkt met ChAcNLS gebruik van sulfo-SMCC als een crosslinker zeer betrouwbaar is. Meestal, wanneer geladen op een 12% gel en geanalyseerd door SDS-PAGE, dit resulteert in een te onderscheiden stapsgewijze verhoging MW evenredig met verhoging van sulfo-SMCC-tot – 7G 3 ratio’s gebruikt en zorgt voor de zware en lichte kettingen worden individueel beoordeeld voor ChAcNLS vervoeging (Figuur 3). 7G 3 reageerde op 10-, 20 – 25- en 50-…

Discussion

Belangrijkste doelstellingen van systemische levering van anti-kanker agenten zijn te verhogen van accumulatie op de site van de tumor, en opname binnen kankercellen, of ongewenste bijwerkingen in de gezonde weefsels. AC gericht levering van moleculaire payloads aan tumorcellen is een zeer veelbelovende benadering behandelen en tumoren op te sporen. Echter het gebrek aan doeltreffendheid veroorzaakt door beklemming van de endosome en beneden lysosomale aantasting van de stream blijft een belangrijke uitdaging. Terwijl di…

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771