Valutazione iniziale di anticorpo-coniugati modificate con peptidi virali-derivati per accumulo cellulare di aumentare e migliorare il Targeting tumorale

Summary

Peptidi virali-derivati accoppiati a anticorpo-coniugati (ACs) è un approccio guadagnando slancio a causa del potenziale di trasporto molecolare payload con accumulo di cellule aumentata del tumore. Utilizzando metodi comuni per valutare la coniugazione di peptide, AC e accumulo intracellulare di payload e targeting tumorale, questo protocollo consente ai ricercatori durante le fasi iniziali di sviluppo chiave.

Abstract

Anticorpo-coniugati (ACs) modificati con peptidi derivati da virus sono potenzialmente potente classe di agenti di consegna delle cellule tumorali per molecolare payloads utilizzati nel trattamento del cancro e di imaging dovuto accumulazione cellulare aumentata sopra SCA corrente. Durante primi AC in vitro sviluppo, tecniche di fluorescenza e metodiche radioimmunologiche sono sufficienti per determinare la localizzazione intracellulare, efficienza di accumulo e specificità delle cellule bersaglio. Attualmente, non ci è consenso su metodi standardizzati per preparare le celle per valutare la localizzazione e l’accumulo intracellulare di AC. La prova iniziale di ACs per volta con peptidi derivati da virus è fondamentale, soprattutto se sono stati costruiti diversi candidati. Determinare l’accumulo intracellulare di fluorescenza può essere influenzata da segnale di fondo da ACs alla superficie delle cellule e complicano l’interpretazione di accumulo. Per metodiche radioimmunologiche, cellule in genere trattate sono frazionate e misurata la radioattività in diversi compartimenti cellulari. Tuttavia, lisi cellulare variano da una cella a altra e spesso nucleari e citoplasmatici scomparti non sono adeguatamente isolate. Questo può produrre dati fuorvianti sulle proprietà di consegna del carico utile. L’iniezione endovenosa di radiomarcato virus-derivato del peptide-modificato ACs nel tumore topi seguiti da formazione immagine del radionuclide del cuscinetto è un potente metodo per la determinazione delle proprietà di recapito di targeting e capacità di carico del tumore alla fase in vivo della sviluppo. Tuttavia, si tratta di un progresso relativamente recente e alcuni gruppi hanno valutato virus-derivato di ACs di peptide-modificato in questo modo. Descriviamo il trattamento delle cellule trattate per valutare con maggiore precisione virus-derivato di accumulo di AC peptide-modificato quando si utilizza metodiche radioimmunologiche e microscopia confocale. In particolare, un metodo per trypsinizing cellule rimuovere la superficie cellulare associato ACs. Forniamo anche un metodo per migliorare il frazionamento cellulare. Infine, questo protocollo fornisce un metodo in vivo tramite tomografia a emissione di positroni (PET) per la valutazione iniziale del tumore come destinazione proprietà nei topi del tumore-cuscinetto. Usiamo il radioisotopo ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12.7 ore) come un payload di esempio in questo protocollo.

Introduction

Anticorpo-coniugati (ACs) sono prodotti biofarmaceutici che stanno maturando in una classe trasformativa di farmaci efficaci per individuare tumori e migliorare i trattamenti del cancro. Composto di un anticorpo monoclonale (mAb) coniugato al payload molecolare come radioisotopi, piccole molecole e tossine biologiche, ACs sono in grado di fornire questi carichi utili alle cellule tumorali con destinazione squisito antigene affinità e specificità. Quindi ACs hanno il potenziale di significativamente ridurre la tossicità aspecifica e aumentare l’attività di carico al luogo del tumore. Terapeuticamente, ACs trasporto citotossiche piccole molecole (comunemente indicate come anticorpo-farmaco coniugati) sono stati approvati per il trattamento di pazienti con cancro al seno e linfoma di Hodgkin che hanno fallito i trattamenti convenzionali ^{1, 2}. Inoltre, radioisotopi trasporto ACs (riferiti a comunemente come radioimmunoconjugates) sono anche in fase di sviluppo. Un AC trasportando un radioisotopo per l’imaging è approvato per l’identificazione di metastasi di carcinoma della prostata ³. Con molti più terapeutico ACs sottoposti per approvazione ⁴, l’ottimismo è alta per il futuro di ACs per migliorare cancro cura ⁵.

Tuttavia, quando si consegnano chemioterapici o radioisotopi, ACs hanno difficoltà accumulando efficacemente questi carichi all’interno delle cellule bersaglio. Questo aspetto contribuisce in maniera significativa in molti casi l’impossibilità di ACs per fornire la sopravvivenza libera da malattia di lunga durata o tumore ad alto contrasto imaging ^6,7. In generale, una volta ACs associare loro antigene bersaglio essi sono interiorizzati attraverso un processo noto come endocytosis ricevitore-mediato. L’ACs sono quindi intrappolato all’interno di endosomi e vittime della tratta ai lisosomi per degradazione e carico utile rilasciare ⁸. Il processo di traffico intracellulare pone sfide per ACs raggiungere una capacità di carico elevata specificità e l’efficacia contro le cellule tumorali bersaglio. Ad esempio, molti antigeni come Her2 (destinazione per terapeutica AC Trastuzumab-emtansine) può riciclare fino all’85% di anticorpi legati ai primi 30 min ⁹. Inoltre, una volta che si verifica degrado, rilasciato chemioterapici e radioisotopi possono essere attivamente esportati da aumentata espressione e/o attività di trasporto di membrana associato proteine ^10,11. Degradazione del lisosoma ostacola anche la consegna di payload romanzo biologici quali gli enzimi terapeutici e oligonucleotidi che possono essere disattivato ^12,13. In sostanza, la cellula tumorale è altamente efficace a abrogare l’accumulazione intracellulare necessario di payload consegnato da ACs.

Questo protocollo viene descritto come implementare il concetto di ACs-accoppiato ai peptidi derivati da virus, specificamente per la fuga endosoma allettamento e localizzazione al nucleo della cellula. Con tale sofisticazione di manipolare sistemi host cella, non è sorprendente che lo sviluppo di proteine derivate da virus e peptidi come potenziali biofarmaci lungo è stato radicato nella ricerca terapeutica ¹⁴. Per milioni di anni i virus hanno evoluto per acquisire un’eccezionale collezione di proteine in grado di sfruttare sistemi di cellule di mammifero fisiologico normale per entrare in modo efficace le cellule ospite. Per i virus che sono interiorizzati via endocytosis ricevitore-mediato, essi sono anche sfidati con l’escape di traffico per il lisosoma dove l’assalto di una concentrazione localizzata delle proteasi può essere problematico per la sopravvivenza. Un ben caratterizzato peptide virale-derivati utilizzato nella consegna della droga per sfuggire endosoma allettamento è il transactivator di virus dell’immunodeficienza umana di trascrizione (Tat) proteina ¹⁵. Tat è in grado di sfuggire l’allettamento endosoma rilevando il punto in cui cambiamenti conformazionali della proteina si verificano abilitazione Tat per inserirsi in e disturbare la membrana endosomal ¹⁶basso pH. In questo modo coniugati Tat-payload in grado di accedere il citoplasma. Il secondo elemento di manipolazione virale relazionato al presente protocollo è l’approccio utilizzato per fornire geni terapeutici e farmaci al nucleo ¹⁷. Virus si sono evoluti per manipolare correttamente macchina cellula ospite per progredire oltre la membrana nucleare passando attraverso il complesso del poro nucleare (NPC). Macromolecole cellulari contengono (o si legano proteine che contengono) proteine (ad es. karyopherins α e β), che forniscono i movimenti richiesti attraverso il NPC di trasporto segnali di localizzazione nucleare (NLSs) per l’associazione al nucleare. Virus hanno sviluppato le proteine per contenere sequenze NLS che forniscono loro la capacità di utilizzare proteine di trasporto cellula ospite per la spola nel nucleo ¹⁸.

ACs numerosi precedentemente sono stati funzionalizzati con peptidi derivati da Tat e NLS e testati per la loro capacità di accumularsi all’interno delle cellule tumorali e per individuare i tumori ^{19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30} (tabella 1). Consegna payload citotossici hanno dimostrato che ACs modificato con peptidi derivati da virus sono in grado di aumentare in modo significativo accumulo cellulare, citotossicità e tumore uccidendo più non modificato ACs ^22,26. Una caratteristica comune per questa nuova classe di AC è la loro costruzione. In genere, peptidi contengono una cisteina terminale fornendo un gruppo solfidrilico libero. MAbs sono in primo luogo ha reagiti con un reticolante bifunzionale noncleavable contenenti N– Idrossisuccinimide (NHS) e gruppi di maleimide alle estremità opposte. Gli esteri di NHS reagiscono con le ammine primarie il mAb per formare legami ammidici. Il mAb ha reagito con maleimide gratis gruppi poi reagisce con i gruppi sulfidrilici sui peptidi per formare un legame tioestere e legando il peptide e mAb. Anche se crosslinkante reticolanti sono stati usati ²⁸, eterobifunzionali crosslinker sono più comunemente utilizzati nella costruzione di virus-derivato del peptide-ACs ^{22,23,26, 31,32}. Questo protocollo utilizza specificamente il reticolante Sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (sulfo-SMCC) per la sua facilità d’uso e perché viene usato nel coniugato anticorpo-farmaco approvato Trastuzumab-emtansine e in molti virus-derivato del peptide-ACs ^{8,22,23,26,31,32}. Elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) è il metodo principale per determinare inizialmente coniugazione efficienza e per semi-quantificazione del numero di peptidi per mAb. Microscopia confocale utilizzando un anticorpo secondario marcato fluorescente specifico per il mAb è in genere il metodo per valutare inizialmente proprietà di distribuzione intracellulare del virus-derivato del peptide-modificato ACs. Finora, radioisotopi sono i payload primari consegnati da virus-derivato del peptide-modificato ACs. Radioisotopi sono vantaggiose perché radioattività nelle cellule è facilmente quantificati contando gamma. Inoltre, ACs che si traducono in modelli murini di cancri umani fornire ai ricercatori la possibilità di valutare il targeting tumorale utilizzando modalità di imaging molecolare come singola emissione del fotone tomografia computata e tomografia a emissione di positroni (PET) ^{23 , 32 , 33}. In generale, la costruzione e la convalida di metodi principalmente utilizzati dai ricercatori di prova forniscono una valutazione molto buona di ACs per volta con peptidi derivati da virus durante la fase di sviluppo iniziale di immettere e fornire efficacemente il carico utile all’interno di cellule bersaglio e ai tumori di destinazione.

Tat – e NLS-modificato ACs hanno illuminati zone chiave per migliorare ulteriormente la consegna del carico utile all’interno di cellule tumorali e ai tumori. Rispetto per volta NLS ACs, l’efficienza in accumulo intracellulare può essere modesto ^23,31,34. L’accumulo intracellulare inefficiente è causata dall’allettamento endosomal continuato. In vivo targeting tumorale può essere diminuito anche con entrambi Tat – e NLS-modificato ACs. Le sequenze attive di Tat e NLS contengono parecchi residui di caricate positive. Quando associata a anticorpi monoclonali, la carica nel complesso cationico può essere significativamente aumentato ³⁵. Di conseguenza, il Tat – e NLS-modificato ACs hanno aumentato l’assorbimento nei tessuti sani e aumento del sangue rapido gioco.

Il nostro gruppo ha sviluppato un composito composto costituito da acido colico collegato a NLS (ChAcNLS; Figura 1). ChAcNLS-modificato ACs sono in grado di aumentare l’accumulo intracellulare di radioisotopi trasportati e migliorare il targeting tumorale rispetto al tradizionale e NLS-modificato ACs ^33,34. Il meccanismo dietro l’acido colico è ispirato dalla possibilità di selezionare trattenere virus che non si basano sulla fusione della membrana di utilizzare acido colico per innescare endosoma fuga attraverso la formazione di ceramide. Ad esempio, suina virus enterici reclute acido colico che attiva sfingomielinasi, che catalizza l’idrolisi della sfingomielina in ceramide ^36,37,38. Questo destabilizza membrana endosomal e permette per la fuga di virus. Così, acido colico è un’altra componente derivato da virus che complementa NLS.

Come questo campo si muove avanti e futuri avanzamenti si verificano nella consegna del carico utile da ACs modificato con peptidi derivati di virus, è il momento opportuno per fornire dimostrazioni visive delle loro caratteristiche biochimiche e funzionali durante lo sviluppo iniziale. Qui, descriviamo il nostro protocollo per la valutazione iniziale del virus-derivato del peptide-modificato ACs per la determinazione semplice ma efficiente di accumulo intracellulare e targeting tumorale durante la prima fase di sviluppo. Usiamo i mAbs commercialmente disponibili 7 3 e A14 come sistemi modello di esempio. Procedura 1 descrive l’uso di SDS-PAGE come un metodo che permette di ‘ go/no go’ decisioni per ACs costruito. Procedura 2 descrive un metodo utilizzando trypsinization permettendo di migliorare la visualizzazione della distribuzione intracellulare di AC e di accumulo. Procedura 3 descrive un metodo per frazionamento migliorata intracellulare determinare con precisione la localizzazione nucleare. In questa procedura che utilizziamo il payload ⁶⁴Cu (t_1/2 = 12.7 ore) perché è vulnerabile a efflusso cellulare ed è un emettitore di positroni ¹⁰. Così, procedura 4 descrive in vivo del tumore targeting caratterizzazione da PET imaging per visualizzare captazione tumorale rispetto al fondo (cioè del nontarget tessuti sani) e determinare se l’esempio AC può specificamente ed efficacemente tumori di destinazione. Questi metodi sono sufficienti per gli investigatori lo sviluppo di ACs per volta con peptidi derivati da virus per identificare i candidati per l’ulteriore avanzamento.

Protocol

In vivo esperimenti sugli animali descritti sono stati effettuati secondo un protocollo approvato e sotto le linee guida etiche del comitato etico di Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke per esperimenti di animali. 1. anticorpo Peptide coniugazione Nota: ChAcNLS possono essere sintetizzati in qualsiasi produttore commerciale peptide o la piattaforma di servizi di sintesi del peptide di università-affiliato. La sintesi di ChAcNLS può essere trovata…

Representative Results

Per procedura 1, la costruzione di 3 7 modificato con ChAcNLS usando sulfo-SMCC come un reticolante è molto affidabile. In genere, quando caricati su un gel di 12% e analizzati da SDS-PAGE, questo risultati in un aumento graduale distinguibile MW proporzionale all’aumento sulfo-SMCC-a – 7 3 rapporti utilizzati e permette per le catene pesanti e leggere essere valutati singolarmente per ChAcNLS Coniugazione (Figura 3). 7G 3 ha reagito a 10, 20, 25 e 50-a-1 sulfo-SMCC-a – …

Discussion

Principali obiettivi di consegna sistemica di agenti anti-cancro sono di accumulo presso il sito del tumore e l’assorbimento all’interno delle cellule tumorali di aumentare e diminuire gli effetti collaterali indesiderati in tessuti sani. Consegna di AC mirati di payload molecolare alle cellule del tumore è un approccio molto promettente per trattare e rilevare i tumori. Tuttavia, la mancanza di efficacia causata dall’allettamento endosoma e giù degradazione lisosomiale flusso rimane una sfida importante. Mentre questo…

Materials

Sulfo-SMCC	Thermo Scientific	22122	There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters	EMD Millipore	UFC505096	There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards	BioRad	1610375EDU	Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	100 or 500 mL volumes to choose from.
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate	Thermo Scientific	A-21235	1-10 μg/mL recommended
NOTA-NHS	CheMatech	C100
Lamin A/C antibody (N-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-6215
Rab7 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376362
A14 mAb	BD Biosciences	555902
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Thermo Scientific	NP0007
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-25ML
TF-1a cells	ATCC	ATCC CRL-2003
RPMI 1640 medium	ATCC	ATCC 30-2001
RIPA lysis and extraction buffer	Thermo Scientific	89900
AMIDE medical imaging software	available at amide.sourceforge.net		Completely free download
FluoView FV1000 Confocal Microscope	Olympus
Fluoview Software	Olympus		www.olympus-lifescience.com
ITLC strips	Biodex	150-771