細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価
Summary
抗体複合体 (ACs) と結合したウイルス由来ペプチドは、細胞に蓄積される高められた腫瘍の分子のペイロードを提供する可能性があるのための勢いを増しているアプローチです。このプロトコル ペプチド共役、AC とペイロードの細胞内蓄積、および腫瘍ターゲットを評価する一般的な方法を利用して、キーの初期開発段階で研究者に役立ちます。
Abstract
ウイルス由来ペプチド抗体抱合 (ACs) は、癌治療に用いられるし、現在 ACs 上高められた細胞の蓄積によるイメージング分子のペイロードの腫瘍細胞配信エージェントの可能性のある強力なクラスです。体外初期 AC 中に開発、蛍光技術、測定で細胞内局在性、蓄積の効率、およびターゲット細胞の特異性を決定するために十分です。現在、AC の細胞内蓄積および局在性を評価するためにセルを準備するための標準化された方法についてのコンセンサスはありません。ACs ウイルス由来ペプチドの最初のテストは、いくつかの候補が構築されている場合に特に重要です。蛍光法による細胞内蓄積を決定する細胞表面で ACs からバック グラウンド信号を受けます、蓄積の解釈を複雑にします。測定、通常扱われた細胞を分別し、別の細胞コンパートメントの放射能を測定します。ただし、セル換散の異なる細胞から細胞へ、しばしば核と細胞質のコンパートメントは十分に絶縁されていません。これは、ペイロード配信のプロパティ上の誤解を招くのデータを生成できます。標識の放射性核種イメージングに続いてマウス腫瘍のウイルス由来ペプチド修飾・ ACs の静脈注射はの体内の段階で腫瘍とペイロードのターゲット配信のプロパティを決定するための強力な方法開発。しかし、これは比較的最近の進歩、いくつかのグループは、この方法でウイルス由来ペプチド修飾 ACs を評価しました。共焦点の顕微鏡検査および測定を使用するときウイルス由来ペプチド修飾 AC の蓄積をより正確に評価する扱われた細胞の処理について述べる.具体的には、トリプシン細胞細胞表面を削除するためのメソッドでは、ACs がバインドされています。我々 はも細胞分別を改善するためのメソッドを提供します。最後に、このプロトコルは、担癌マウスのプロパティをターゲットと初期の腫瘍を評価するためポジトロン断層法 (PET) を用いた生体内のメソッドを提供します。我々 は放射性同位元素64Cu を使用して (t1/2 = 12.7 h) この議定書の例ペイロードとして。
Introduction
抗体複合体 (ACs) は、癌治療を改善するため、腫瘍を検出するための効果的な薬の変革クラスに成熟しているバイオ医薬品です。放射性、小分子生物毒素など分子のペイロードに共役モノクローナル抗体 (mAb) から成る、ACs が絶妙なターゲット抗原親和性と特異性を持つがん細胞にこれらのペイロードを提供することができます。こうして ACs 大幅に非特異的な毒性を軽減し、腫瘍部位でペイロード活動を増やす可能性があります。ACs 細胞傷害性小分子 (抗体薬物複合体としてとも呼ばれる) を輸送を従来の治療1,を失敗した乳癌、ホジキン リンパ腫患者の治療に承認されている治療、2。 加えて、ACs 輸送放射性同位元素 (通称: radioimmunoconjugates) が開発。イメージング放射性同位元素を運搬 AC 3前立腺がん転移を識別する承認されています。多くのより治療 ACs 申請承認4、楽観主義ががんケア5を改善するために ACs の未来のため高い。
それにもかかわらず、化学療法または放射性同位元素等を配送するときに、効果的に標的細胞内これらのペイロードを蓄積困難である ACs。この側面は、長期無病生存率やコントラストの高い腫瘍6,7をイメージングを提供する ACs の無力で多くの場合大きく貢献しています。一般に、ACs バインドのターゲット抗原一度彼らは受容体を介したエンドサイトーシスと呼ばれるプロセスを通じて内面化します。ACs はエンドソーム内部に陥れた劣化のリソソームに人身売買し、ペイロードを解放8。細胞内の輸送プロセス高ペイロードの特異性とターゲット癌細胞に対する有効性を達成するために ACs の課題があります。たとえば、多く抗原 Her2 など (ターゲット治療 AC トラスツズマブ emtansine) は、最初の 30 分の9に結合した抗体の 85% までをリサイクルできます。さらに、劣化が発生すると、リリースされた化学療法および放射性同位元素等積極的にエクスポートできます発現の増加および/または関連付けられる膜輸送タンパク質10,11の活動。ライソゾームの分解も阻害治療酵素など新規生物学的ペイロードの配信と非アクティブにすることができますオリゴヌクレオチド12,13。本質的に、がん細胞は、ACs によって提供されるペイロードの必要な細胞内蓄積を abrogating に効果的です。
このプロトコルでは、エンドソームわなに掛ける事を脱出し、細胞核へのローカライズ用のウイルス由来ペプチドに ACs 結合の概念を実装する方法について説明します。セルのホスト システムを操作するような洗練された、じゃないから潜在的なバイオ医薬品としてウイルス由来のタンパク質・ ペプチドの開発長い治療研究14に染み付いています。数百万年のウイルスは宿主細胞を効率的に入力するために正常な生理学的な哺乳類細胞システムを悪用することができる蛋白質の優れたコレクションを取得する進化しています。受容体を介したエンドサイトーシスを介して内在化されているウイルス、彼らはエスケープがリソソームに人身売買のプロテアーゼのローカライズされた濃度の猛攻撃が生存のため問題が発生することができますも挑戦しました。エンドソームわなに掛ける事を脱出するためのドラッグデリバリーにおける活用も特徴とウイルス由来ペプチドは、転写 (Tat) 蛋白質15のひと免疫不全ウイルス トランスです。Tat は、低 pH その時点で蛋白質のコンフォメーション変化発生にそれ自身を挿入し、エンドソーム膜16を混乱させる有効にする Tat の感知によるエンドソームわなに掛ける事をエスケープすることです。これは、結果、Tat ペイロード抱合体細胞質にアクセスすることができます。このプロトコルに関連する 2 番目のウイルスの処理要素は、核17を治療用遺伝子や薬を提供するために使用するアプローチです。ウイルスは、正常に過去の核膜核膜孔複合体 (NPC) を通過して進んでいるためホスト細胞の機械を操作するために進化してきました。細胞高分子含まれている (または含まれているタンパク質に結合) 核のバインドに必要な核局在化信号 (NLSs) 輸送蛋白質 (例えばkaryopherins α、β) NPC を通じて必要な動きを提供します。ウイルスは、ホスト細胞輸送タンパク質核18に往復を利用する能力を提供する NLS シーケンスを含むタンパク質を開発しています。
多数の ACs が以前 Tat と NLS 由来ペプチド修飾し、癌細胞内に蓄積する能力を対象化、腫瘍19,20,21,22 テスト、23,24,25,26,27,28,29,30 (表 1)。細胞傷害性ペイロードを提供する調査は ACs ウイルス由来ペプチドが未変更 ACs 22,26を殺す腫瘍、細胞毒性、細胞蓄積を大幅に増加させることができることを示した。AC のこの新しいクラスの共通の特徴は、その建設です。通常、ペプチッドには無料スルフヒ グループを提供するターミナル システインが含まれています。Mab は、まずNヒドロキシスクシンイミド (NHS) と両端のマレイミド グループを含む noncleavable 二官能性架橋剤と反応しました。NHS のエステルは、アミド結合を形成する mAb の第一級アミンと反応します。無料マレイミド グループと反応の mAb はチオエステル結合、ペプチドと mAb をこのようにリンクを形成するペプチド スルフヒ グループと、反応しました。Heterobifunctional 架橋剤がウイルス由来ペプチド ACs 22,23,26の構造で使用されるより一般的 homobifunctional 塗料の硬化剤は、使用される28をされていますが、 31,32。このプロトコル具体的に使用する架橋剤 sulfosuccinimidyl 4-(N maleimidomethyl) シクロヘキサン-1-カルボン酸 (スルホ SMCC) その使いやすさのためとの多くの承認された抗体医薬の共役のトラスツズマブ emtansine で使用されるので、ウイルス由来ペプチド ACs 8,22,23,26,31,32。ナトリウム dodecyl 硫酸塩のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 最初の活用効率を決定するための主な方法は、半定量化 mAb あたりペプチド数。蛍光標識二次抗体 mAb に固有を用いた共焦点顕微鏡は、当初ウイルス由来ペプチド修飾 ACs の細胞内の分布特性の評価方法です。これまでは、放射性同位元素、ウイルス由来ペプチド修飾 ACs によって提供される主なペイロードです。放射性同位元素は、細胞における放射能はガンマを数えることで簡単に算出できるので有利であります。さらに、ヒトのガンのマウス ・ モデルに変換される ACs は腫瘍ターゲット分子のイメージ投射様相を使用する単一光子放出コンピューター断層撮影、ポジトロン断層法 (PET) を評価する能力を持つ研究者を提供します。23,32,33します一般に、建設と検証試験方法の研究者によって主に使用される効果的に入力し提供する開発の初期段階でウイルス由来ペプチド修飾 ACs の非常に良い評価を提供、。ペイロード内標的細胞と腫瘍を標的。
さらに腫瘍の癌細胞中のそしてペイロードの配信を改善するための照明キー分野 Tat と NLS-修飾 ACs があります。NLS 変更 ACs に対して細胞内蓄積効率はささやかな23,31,34をすることができます。非効率的な細胞内蓄積は、エンドソームの継続的なわなに掛ける事が原因です。生体内で腫瘍が対象とすることができますもに減少すると両方 Tat と NLS-修飾 ACs。Tat および NLS のアクティブなシーケンスには、いくつかの正荷電残基が含まれています。モノクローナル抗体に接続されて、全体的なカチオンは大幅に増加した35をすることができます。結果として、Tat-NLS-変更 ACs が健全なティッシュの取り込みを増加、および急速な血のクリアランスを増加しました。
当社グループは、複合化合物を開発した NLS (ChAcNLS; にリンクされている胆汁酸から成る図 1)。ACs の ChAcNLS 変更は、提供された放射性同位元素の細胞内蓄積を増加し、腫瘍標的 NLS 変更と伝統的な ACs 33,34と比較して向上させることができます。胆汁酸の後ろのメカニズムは、セラミドの形成からエンドソーム脱出をトリガーする胆汁酸を利用する膜融合に頼ることはできません選択のノンエンベ ロープ ウイルスの機能に触発されます。たとえば、ブタの腸内ウイルス募集コール酸セラミド36,37,38にスフィンゴミエリンの加水分解を触媒するスフィンゴミエリナーゼをアクティブにしています。これはエンドソームの膜を不安定化、ウイルスのエスケープできます。胆汁酸は、NLS を補完する別のウイルス由来のコンポーネントです。
このフィールド移動する前方および将来ウイルス由来ペプチド、ACs によってペイロード配達で進歩が発生するは、初期の開発中の生化学的, 機能的特性の視覚的なデモを提供するために計ります。ここでは、細胞内蓄積と腫瘍は初期の段階の開発中にターゲットの効率的かつ簡単な定量、ウイルス由来ペプチド修飾 ACs の初期評価のための私達のプロトコルについて述べる。我々 は、例をモデル系として市販 Mab 7 3 と A14 を使用します。手順 1 では、構築された ACs の ‘go’ 決定するためことができる方法として SDS ページの使用について説明します。手順 2 では、trypsinization AC 細胞内分布と蓄積の改善された可視化を可能にするを使用して、メソッドについて説明します。3 核局在を正確に判断する改良された細胞分別の方法を示します。ペイロード64Cu を駆使し、この手順で (t1/2 = 12.7 h) は細胞排出されやすい、陽電子のエミッター 10 のため。したがって、手順 4 が生体内の腫瘍ペット画像を背景 (すなわち非標的健全なティッシュ) 腫瘍の取り込みを視覚化し、AC の例が具体的かつ効果的にできるかどうかを決定する評価をターゲットについて説明しますターゲット腫瘍。これらのメソッドは、さらに進歩のための候補者を識別するために ACs ウイルス由来ペプチドの開発調査官に対して十分です。
Protocol
Representative Results
Discussion
抗がん剤の全身配信の主な目標は、腫瘍部位でがん細胞内取り込み蓄積を増加して健全なティッシュの不必要な副作用を減らすです。腫瘍細胞に分子のペイロードの AC ターゲット配信は、治療し、腫瘍を検出する非常に有望なアプローチです。ただし、有効性の欠如は、エンドソームわなに掛ける事によって引き起こされ、ストリーム ライソゾーム劣化を重要な課題のまま。このプロトコ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、癌研究会 (カナダ) と CIM によって賄われていた。著者は、博士サミア Ait-Mohand、ジャン = フランソワ Beaudoin を支援ありがちましょう。MAb A14 の博士天使ロペス (大学南オーストラリア)。
Materials
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from. |
| Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters | EMD Millipore | UFC505096 | There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs. |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200056 | 100 or 500 mL volumes to choose from. |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Scientific | A-21235 | 1-10 μg/mL recommended |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C antibody (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a cells | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 medium | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermo Scientific | 89900 | |
| AMIDE medical imaging software | available at amide.sourceforge.net | Completely free download | |
| FluoView FV1000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Fluoview Software | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC strips | Biodex | 150-771 |
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