הכנת פנים של כלי דם עכבר
Summary
נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal.
Abstract
חלקים של רקמות מוטבע פרפין משמשים באופן שגרתי לחקר היסטולוגיה רקמות היסטופתולוגיה. עם זאת, קשה לקבוע מה מורפולוגיה רקמת תלת מימדי הוא מן הסעיפים האלה. בנוסף, קטעים של רקמות שנבדקו לא יכול להכיל את האזור בתוך הרקמה הדרושה לצורך המחקר המתמשך. הגבלה זו מעכבת מחקרים היסטופאתולוגיים של כלי הדם מאז לפתח נגעים וסקולריים באופן ממוקד. זה דורש שיטה המאפשרת לנו לסקור שטח רחב של קיר כלי הדם, מפני השטח שלו לאזורים עמוקים יותר. הר שלם בפנים הכנה של כלי הדם ממלא דרישה זו. במאמר זה, נוכל להדגים כיצד לעשות ההכנות פנים של אבי העורקים בעורק ואת עורק הצוואר כדי כתם immunofluorescently עבור מיקרוסקופיה confocal וסוגים אחרים של הדמיה מבוססי פלואורסצנטי.
Introduction
עבור מחקרים היסטופתולוגיים על ידי מיקרוסקופ אור, שלוש חתיכות ממדי של רקמות ביולוגיות מעובדות באופן שגרתי עבור emaffment פרפין ואחריו חתך מכתים. מדגם רקמה כי כבר מוטבע paraffin עשוי להיות כמה מילימטרים בכל שלושת הממדים. עם זאת, לצורך מיקרוסקופ אור, זה חייב להיות מחולק הראשון, כך האור יכול לעבור ולאחר מכן מוכתמים כך בסעיף דק תשואות בניגוד מספיק הדמיה. בגלל דגימות מחולקים הם בדרך כלל 5-10 מיקרומטר עובי, אחד רואה רק חלק קטן מאוד של הדגימה כולה בשני ממדים בכל פעם. ניתן לאסוף סעיפים עוקבים, לאחר הדמיה כל סעיף בנפרד, לבצע שחזור ממוחשב בסיוע של תמונות 3D, אבל זו עבודה מייגעת אכן. Histopathology של כלי הדם, במיוחד לחקר הפתוגנזה של טרשת עורקים, מציג בעיות ייחודיות. טרשת עורקים היא מחלה מתפתחת שמתפתחתבאופן מקומי באזורים בהם מתרחשת זרימת דם מופרעת. יתר על כן, המחלה היא יזמה בתוך האינטימה, רקמה דקה המורכבת monolayer של תאים אנדותל ו מטריקס תאיים, של העורקים הגדולים. מסיבות אלה, זהו אתגר לאתר ולחקור lesions מוקדם באמצעות כלי הדם מחולק כי אחד יכול בקלות להחמיץ חתך את הנגע. גם אם סעיף כולל אזור חולה, אחד יראה רק חלק 5-10 מיקרומטר המכיל תאים אנדותל ותאי קיר כלי דם אחרים בתקשורת adventitia.
הר שלם בפנים (המובהק än fäs) ההכנות מאפשרות לנו סקר שטח רחב של משטח כלי הדם כגון האאורטה כולה מן שורש אבי העורקים כל הדרך עד לעורקים השד הנפוצים. באמצעות דוגמה כזו מוכתם נוגדנים ספציפיים ובדיקות ספציפיות אחרות, ניתן לאתר את המיקום של נגעים וגם שם אירועים מולקולריים שונים להתרחש בתאי אנדותל יחד עם wiכמו שינויים בביטוי, בלוקליזציה ושינויים פוסט-טראנסציוניים של חלבונים. בנוסף ללימוד אנתרוגנזה, צורת התא האנדותל שנצפתה בהכנות לפנים משמשת אינדיקטור לתבנית זרימת הדם הממוצעת בזמן. נתונים אלה חשובים ללימוד mechanosignaling של תאים אנדותל באתרם. לשם כך, שגרתית היסטולוגית חתך כלי הדם אינם שימושיים. לכן, עבור רפואה וסקולרית וביולוגיה, חשוב במיוחד לרכוש טכניקה להכנת ההכנות הפנים של כלי הדם המאפשר אחד להתבונן שטח רחב של משטח כלי השיט, כמו גם את אזורים תת קרקעיים עמוק יותר של כלי השיט.
כפי שנבדקו על ידי Jelev ו Surchev 1 , ביולוגים כלי הדם פיתחו שיטות שונות כדי לצפות בטנה של כלי הדם על הפנים. כמה שיטות גאוני פותחו בשנות 1940 ו 1950 של. באמצעות שיטות אלה, הם היו מסוגל ללמוד את הארגון הבסיסי של תאים אנדותל כי קו פני השטח הפנימיים של כלי הדם. עם זאת, בגלל הדרך ההכנות האלה מוכנים מוכנים (מה שנקרא שיטת Hautchen 2 , 3 , 4 או קילוף את פני השטח של כלי השיט 5 ) ואת האופן שבו הדגימה היה מוכתם, זה לא תמיד היה ניתן להשיג ללא הפרעה מורפולוגית מידע מכלי השיט אל האזורים העמוקים יותר של דופן כלי הדם. הר שלם בפנים הכנה הכנה בשילוב עם מכתים immunofluorescence אפשרה לנו לא רק ללמוד מורפולוגיה תא האנדותל ביטוי חלבון לוקליזציה בתאים אלה, אלא גם כדי להרחיב מחקרים כאלה לאזור subendothelial של קיר כלי השיט. מחקרים מוקדמים באמצעות ההכנות כלי דם פנים מוכתם immunoflorescently החלו להופיע בשנות ה -1980 של 6 ,F "> 7. עם הופעתו של מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal ומיקרוסקופ multiphoton לאחרונה יותר לאחרונה, אחד יכול כעת לקבל תמונות ברורה להתמקד של כלי הדם מבנה הקיר בדגימות כלי רכב מוכתמים immunofluorescently אל פנים, כמו גם את רשת כלי הדם בבעלי חיים חיים 8 , 9 , 10 , 11. אלה מבוססי מחשב טכניקות הדמיה ליצור במיקוד אופטי חתך תמונות, ועל ידי ערימת תמונות כאלה, אפשר לקבל תמונות 3D משוחזרים של קיר כלי הדם ואת רשת כלי הדם ברקמות.בנוסף, אחד יכול ליצור תמונות של קטע שנעשה לאורך ציר ה- Z של התמונה המשוחזרת 12 , 13 .
במאמר זה, נוכל להמחיש שיטה להכנת ההכנות פנים של אבי העורקים העכבר ואת עורק הצוואר מכתים אימונופלורסנט. הכנות פניםיכול להתבצע גם לאחר כלי אלה כבר מניפולציה ניסיונית. לדוגמה, עורק הראש יכול להיות ligated חלקית ולאחר מכן הכנה פנים עשה לאחר ניתוח כזה. מסיבה זו, אנו גם לתאר במאמר זה איך אנחנו עושים קשירת חלקית על עורק הצוואר. בהשוואה להכנת תכשירים דומים מחיות גדולות יותר, כגון עכברושים, ארנבות ובני אדם, כלי העכברים קטנים בגודלם ובריריים יותר, מה שדורש טיפול נוסף לטיפול במהלך בידוד כירורגי של כלי הדם והכנתם לצביעת נוגדן ומיקרוסקופ. בגלל המודל החייתי הנפוץ ביותר עבור שינוי גנטי הוא העכבר, זה הופך להיות קריטי עבור חוקרים רבים להתמודד עם כלי העכבר מבלי לפגוע בהם. בכתב יד זה, נתאר כיצד להתמודד עם כלי הדם העכבר בעת ביצוע ההכנות פנים של אבי העורקים בעורק ואת עורק הצוואר. לצורך ההדגמה, נשתמש בעכברי בר C57 / b6.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאשר הטיפול בכלי הדם העכבר, חשוב לזכור כי האנדותל הוא שביר וכי כל כוח מכני מוגזם יפגע בתאי אנדותל. לדוגמה, תאים אנדותל לשבור או לנתק מן הקיר כלי אם כלי הוא perfused חזק מדי, אשר יכול לקרות בקלות כאשר vasculature הוא perfused באמצעות מזרק מופעל ביד.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rt…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פעילות המחקר של המחברים נתמכים על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לד"ר אייב (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -. S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -. T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
