マウスの血管の顔面準備
Summary
マウス頸動脈および大動脈の顔面の準備を行う手順が記載されている。そのような調製物は、特異的抗体で免疫蛍光染色されたとき、共焦点顕微鏡法によってタンパク質の局在化および血管壁全体の細胞型の同定を研究することができる。
Abstract
パラフィン包埋組織の切片は、組織組織学および組織病理学の研究に日常的に使用されている。しかしながら、このような切片から三次元組織形態が何であるかを決定することは困難である。さらに、検査される組織の切片は、進行中の研究の目的に必要な組織内の領域を含まないことがある。この後者の制限は、血管病変が局所的に発達するので、血管の組織病理学的研究を妨げる。これには、表面からより深い領域まで、血管壁の広い領域を調査できる方法が必要です。血管の全面的な準備は、この要件を満たす。この記事では、マウス大動脈と頚動脈の顔面の準備を行い、共焦点顕微鏡法や他の蛍光ベースのイメージングのために免疫蛍光染色する方法を実演します。
Introduction
光学顕微鏡による組織病理学的研究のために、三次元の生物学的組織片をパラフィン包埋のために日常的に処理し、続いて切片化および染色を行う。パラフィン包埋された組織サンプルは、3次元すべてで数ミリメートルであってもよい。しかし、光学顕微鏡の目的のためには、薄い部分が画像化に十分なコントラストをもたらすように、光を通過させて染色することができるように、最初に切断する必要がある。断切られた試験片は、通常、厚さが5〜10μmであるため、一度に2つの寸法の試験片全体のごくわずかな部分のみを見る。逐次セクションを収集し、各セクションを個別にイメージングした後、3D画像のコンピュータ支援再構成を実行することは可能ですが、実際これは面倒な作業です。特にアテローム性動脈硬化症の病因を研究するための血管の組織病理学は、独特の問題を提示する。アテローム性動脈硬化症は、発症する限局性疾患である血流が乱れる領域に局所的に存在する。さらに、この病気は、内膜細胞および大型動脈の単層からなる薄い組織である内膜内で開始される。これらの理由から、切開された血管を用いて早期の病巣を見つけて勉強することは、病変の切開を容易に逃すことができるので困難である。切片に病変領域が含まれていても、培地および外膜に内皮細胞および他の血管壁細胞を含む5〜10μm部分のみが見られる。
全体マウント面は、大動脈根から総腸骨動脈までの全大動脈など、血管表面の広い領域を調べることができます。特定の抗体および他の特異的なプローブで染色されたそのような検体を使用して、病変の位置を特定することができ、様々な分子事象が、内皮細胞において、タンパク質の発現、局在化、および翻訳後修飾の変化などのアテローム発生が含まれる。アテローム発生を研究することに加えて、顔面標本で観察された内皮細胞の形状は、時間的に平均化された血流パターンの指標として使用される。このようなデータは、その場での内皮細胞の機械的シグナル伝達を研究するために重要である。この目的のために、通常の組織学的断面血管は有用ではない。したがって、血管医学および生物学のためには、血管表面の広い領域および血管のより深い地下領域を観察することを可能にする、血管の顔面の準備を行う技術を獲得することが特に重要である。
Jelev and Surchev 1が概説したように、血管生物学者は、血管の内面を観察するための様々な方法を開発してきた。 1940年代と1950年代にはいくつかの独創的な方法が開発されました。これらの方法を使用して、彼らは血管の内面を覆う内皮細胞の基本的な組織を研究することができます。しかしながら、これらの表面調製物が調製される方法（いわゆるHautchen法2,3,4または容器表面5の剥がれ）および試料が染色される方法のために、途切れのない形態学を得ることは必ずしも可能ではなかった血管表面から血管壁のより深い領域への情報。免疫蛍光染色と組み合わされた全面的な血管造影は、内皮細胞形態およびこれらの細胞におけるタンパク質発現および局在を研究するだけでなく、そのような研究を血管壁の内皮下領域にまで拡張することを可能にした。 1980年代には、免疫蛍光で染色された血管内皮調製物を用いた初期の研究が始まり、f "> 7。レーザー走査共焦点顕微鏡検査および最近の多光子顕微鏡検査の出現により、免疫蛍光染色された顔面の血管試料および生きた動物の血管網における血管壁構造の明瞭な合焦画像を得ることができるこれらのコンピュータベースの画像化技術は、合焦された光学断面画像を生成し、このような画像を積み重ねることによって、組織内の血管壁および血管ネットワークの再構成された3D画像を得ることができる。再構成画像12,13の Z軸に沿って作られた断面の画像を生成することができる。
この記事では、免疫蛍光染色のためのマウス大動脈および頸動脈の顔面調製物の調製方法を説明する。顔面準備これらの容器が実験的に操作された後でも行うことができる。例えば、頸動脈を部分的に結紮した後、そのような手術の後に顔面標本を作製することができる。このため、この記事では、頸動脈の部分的な結紮をどのように行うのかについても説明します。ラット、ウサギ、ヒトなどのより大きな動物から同様の調製物を調製する場合と比較して、マウス血管は、サイズが小さく、より壊れ易いため、血管の外科的分離中の取扱いおよび抗体染色および顕微鏡検査のためのそれらの調製に対する注意が必要とされる。遺伝子改変のために最も一般的に使用される動物モデルはマウスであるため、多くの研究者がマウス血管を損傷することなく処理することが重要になります。この原稿では、マウス大動脈と頸動脈の顔面撮影を行う際に、マウスの血管をどのように扱うかを説明します。デモンストレーションの目的で、野生型C57 / b6マウスを使用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウスの血管を扱うときは、内皮が壊れやすく、過剰な機械的な力が内皮細胞に損傷を与えることを覚えておくことが重要です。例えば、血管があまりにも強く灌流された場合、内皮細胞は血管壁から壊れたり離脱したりする。これは、脈管構造が手動シリンジを用いて灌流されたときに容易に起こり得る。
一定の灌流圧を得るために、120cmの水柱圧を有する重力灌流シ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らの研究活動は、国立衛生研究所から阿部博士（HL-130193、HL-123346、HL-118462、HL-108551）の助成金によって支えられている。
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
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