Подготовка к зачатию кровеносных сосудов мыши
Summary
Описана процедура приготовления препаратов на лицевой стороне сонной артерии и аорты мышей. Такие препараты, при иммунофлуоресцентном окрашивании специфическими антителами, позволяют нам изучать локализацию белков и идентификацию типов клеток во всей сосудистой стенке с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
Секции парафиновых включенных тканей обычно используются для изучения гистологии тканей и гистопатологии. Однако трудно определить, что представляет из себя трехмерная морфология ткани. Кроме того, участки исследуемых тканей могут не содержать области внутри ткани, которая необходима для целей текущего исследования. Это последнее ограничение препятствует гистопатологическим исследованиям кровеносных сосудов, поскольку сосудистые поражения развиваются фокально. Это требует метода, который позволяет нам исследовать широкую область стенки кровеносного сосуда, от ее поверхности до более глубоких областей. Этого требует выполнение целого подхода к подготовке кровеносных сосудов. В этой статье мы продемонстрируем, как сделать лицевые препараты мышиной аорты и сонной артерии и иммунофлуоресцентно окрасить их для конфокальной микроскопии и других типов изображений на основе флуоресценции.
Introduction
Для гистопатологических исследований с помощью световой микроскопии трехмерные куски биологических тканей обычно обрабатывают для встраивания парафинов с последующим разделением и окрашиванием. Образец ткани, который был встроен в парафин, может иметь размеры в несколько миллиметров во всех трех измерениях. Однако для целей световой микроскопии его необходимо сначала срезать так, чтобы свет мог проходить сквозь него, а затем окрашивался, чтобы тонкая секция получала достаточный контраст для получения изображений. Так как срезанные образцы обычно имеют толщину 5-10 мкм, то можно увидеть только очень небольшую часть всего образца в двух измерениях за один раз. Можно собирать последовательные секции и, после визуализации каждой секции индивидуально, выполнить компьютерную реконструкцию трехмерных изображений, но это действительно утомительная работа. Гистопатология кровеносных сосудов, особенно для изучения патогенеза атеросклероза, представляет уникальные проблемы. Атеросклероз является очаговым заболеванием, которое развиваетсяЛокально в местах, где происходит нарушение кровообращения. Кроме того, болезнь начинается в интиме – тонкой ткани, состоящей из монослоя эндотелиальных клеток и внеклеточного матрикса больших артерий. По этим причинам, найти и изучить ранние поражения с использованием секционных кровеносных сосудов – задача непростая, так как можно легко пропустить раздел поражения. Даже если в разрезе имеется больная область, в средах и адвентициях будет наблюдаться только часть размером 5-10 мкм, содержащая эндотелиальные клетки и другие клетки сосудистой стенки.
Препараты с цельной консистенцией (выраженные в фэс) позволяют нам исследовать широкую область поверхности кровеносных сосудов, такую как вся аорта, от корня аорты вплоть до общих подвздошных артерий. Используя такой образец, окрашенный специфическими антителами и другими специфическими зондами, можно точно определить место повреждения, а также, когда в эндотелиальных клетках происходят различные молекулярные события, в сочетании с wiГо атерогенеза, таких как изменения экспрессии, локализации и посттрансляционные модификации белков. В дополнение к изучению атерогенеза, форма эндотелиальных клеток, наблюдаемая в препаратах на лице, используется в качестве индикатора региональной усредненной по времени картины кровотока. Такие данные важны для изучения механосигнального процесса эндотелиальных клеток in situ. Для этой цели обычные гистологические поперечные срезы крови не пригодны. Таким образом, для сосудистой медицины и биологии особенно важно приобрести методику для подготовки лицевых препаратов кровеносных сосудов, которая позволяет наблюдать большую площадь поверхности сосуда, а также более глубокие подповерхностные области сосуда.
В обзоре Jelev and Surchev 1 , сосудистые биологи разработали различные методы для наблюдения за облицовкой кровеносных сосудов. Некоторые гениальные методы были разработаны в 1940-х и 1950-х годах. Используя эти методы, они Способных изучать фундаментальную организацию эндотелиальных клеток, которые выстилают внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Однако из-за того, как эти препараты готовятся (так называемый метод Hautchen 2 , 3 , 4 или отслоение поверхности сосуда 5 ), а также от того, как образец был окрашен, не всегда можно было получить непрерывную морфологию Информацию с поверхности сосуда в более глубокие области стенки кровеносного сосуда. Препарат для всего гомеопатического сосуда в сочетании с иммунофлуоресцентным окрашиванием позволил нам не только изучить морфологию эндотелиальных клеток, экспрессию и локализацию белка в этих клетках, но и распространить такие исследования на субэндотелиальную область стенки сосуда. Ранние исследования с использованием препаратов для подготовки кровеносных сосудов, окрашенных иммунофлюоресцентно, начали появляться в 80-х годах 6 ,F "> 7. С появлением лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и в последнее время многофотонной микроскопии теперь можно получить четкие фокусные изображения структуры стенок кровеносных сосудов в образцах иммунофлуоресцентно окрашенных образцов сосудов, а также сосудистой сети у живых животных 8 , 9 , 10 , 11. Эти компьютерные методы визуализации создают фокусированные оптические секционные изображения, и путем складывания таких изображений можно получить восстановленные трехмерные изображения стенки сосуда и сосудистой сети в тканях. Может генерировать изображения секции, выполненной вдоль оси Z восстановленного изображения 12 , 13 .
В этой статье мы проиллюстрируем способ подготовки лицевых препаратов мышечной аорты и сонной артерии для иммунофлуоресцентного окрашивания. Подготовка к зачарованиюМогут быть сделаны даже после экспериментального манипулирования этими сосудами. Например, сонную артерию можно частично лигировать, а затем получить лицевую подготовку, сделанную после такой операции. По этой причине мы также опишем в этой статье, как мы выполняем частичную перевязку на сонной артерии. По сравнению с приготовлением подобных препаратов у более крупных животных, таких как крысы, кролики и люди, мышечные сосуды небольшие по размеру и более хрупкие, что требует дополнительной осторожности при обращении во время хирургической изоляции сосудов и их приготовления для окрашивания антител и микроскопии. Поскольку наиболее часто используемой моделью животных для генетической модификации является мышь, для многих исследователей критически важно обрабатывать сосуды мыши, не повреждая их. В этой рукописи мы расскажем о том, как обрабатывать кровеносные сосуды мыши при приготовлении лицевых препаратов мышечной аорты и сонной артерии. Для демонстрации мы будем использовать мышей дикого типа C57 / b6.
Protocol
Representative Results
Discussion
При обработке мышечных кровеносных сосудов важно помнить, что эндотелий является хрупким и что любая чрезмерная механическая сила повредит эндотелиальные клетки. Например, эндотелиальные клетки разрушаются или отсоединяются от стенки сосуда, если сосуд слишком интенсивно перфузиру…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследовательская деятельность авторов поддерживается грантами Национального института здравоохранения доктору Абе (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -. S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -. T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
