في إعداد الوجه من ماوس سفن الدم
Summary
ويرد وصف لإجراء صنع الاستعدادات وجهه من الشريان السباتي الماوس والشريان الأبهر. هذه الاستعدادات، عندما ملطخة إمونوفلورزنتلي مع الأجسام المضادة محددة، تمكننا من دراسة توطين البروتينات وتحديد أنواع الخلايا داخل جدار الأوعية الدموية بأكمله من قبل المجهر متحد البؤر.
Abstract
يتم استخدام أجزاء من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين بشكل روتيني لدراسة الأنسجة الأنسجة والتشريح المرضي. ومع ذلك، فإنه من الصعب تحديد ما هو مورفولوجيا الأنسجة ثلاثية الأبعاد من هذه المقاطع. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أقسام الأنسجة فحصها قد لا تحتوي على المنطقة داخل الأنسجة اللازمة لغرض الدراسة الجارية. هذا الحد الأخير يعوق الدراسات النسيجية للأوعية الدموية منذ الآفات الوعائية تتطور بطريقة محورية. وهذا يتطلب طريقة تمكننا من مسح مساحة واسعة من جدار الأوعية الدموية، من سطحه إلى مناطق أعمق. كامل جبل إن وجه إعداد الأوعية الدموية يستوفي هذا الشرط. في هذه المقالة، ونحن سوف تثبت كيفية جعل الاستعدادات وجهه من الشريان الأورطي الماوس والشريان السباتي و إمونوفلورزنتلي وصمة عار لهم للمجهر متحد البؤر وأنواع أخرى من التصوير القائم على مضان.
Introduction
للدراسات النسيجية بواسطة المجهر الضوئي، يتم معالجة قطع ثلاثية الأبعاد من الأنسجة البيولوجية بشكل روتيني لتضمين البارافين تليها باجتزاء وتلطيخ. عينة الأنسجة التي تم البارافين جزءا لا يتجزأ قد تكون عدة مليمترات في جميع الأبعاد الثلاثة. ومع ذلك، لغرض المجهر الضوئي، يجب أن يكون مقطوع أولا بحيث الضوء يمكن أن تمر ومن ثم ملطخة بحيث قسم رقيقة ينتج تباين كاف للتصوير. لأن العينات المقسمة عادة ما تكون 5-10 ميكرون في سمك، واحد يرى سوى جزء صغير جدا من العينة بأكملها في بعدين في وقت واحد. فمن الممكن لجمع المقاطع متتابعة، وبعد التصوير كل قسم على حدة، إجراء إعادة بناء بمساعدة الكمبيوتر من الصور 3D، ولكن هذا هو عمل شاق في الواقع. التشريح المرضي للأوعية الدموية، وخاصة لدراسة التسبب في تصلب الشرايين، ويعرض مشاكل فريدة من نوعها. تصلب الشرايين هو مرض متطور يتطورمحليا في المناطق التي يحدث فيها تدفق الدم المضطرب. وعلاوة على ذلك، يبدأ المرض داخل البطانة، وهو نسيج رقيق يتكون من أحادي الطبقة من الخلايا البطانية والمصفوفة خارج الخلية، من الشرايين الكبيرة. لهذه الأسباب، فإنه من الصعب تحديد ودراسة الآفات المبكرة باستخدام الأوعية الدموية مقطوع لأنه يمكن للمرء أن يغيب بسهولة باجتزاء الآفة. حتى إذا كان القسم لا يشمل منطقة مريضة، واحد سوف نرى فقط 5-10 ميكرون جزء يحتوي على الخلايا البطانية وغيرها من خلايا جدار الأوعية الدموية في وسائل الإعلام والدفنتية.
كل جبل إن وجه (وضوحا än فاس) الاستعدادات تسمح لنا لمسح مساحة واسعة من سطح الأوعية الدموية مثل الشريان الأورطي بأكمله من الجذر الأبهر على طول الطريق وصولا الى الشرايين الحرقفية المشتركة. باستخدام مثل هذه العينة ملطخة الأجسام المضادة محددة وتحقيقات محددة أخرى، يمكن للمرء تحديد موقع الآفات وأيضا حيث تحدث الأحداث الجزيئية المختلفة في الخلايا البطانية بالتزامن وايالتصلب العضلي مثل التغيرات في التعبير، والتعريب، والتعديلات بوستترانزلاتيونال من البروتينات. بالإضافة إلى دراسة تصلب الشرايين، يتم استخدام شكل الخلايا البطانية لوحظ في الاستعدادات وجه إن كمؤشر على نمط تدفق الدم في المتوسط الوقت الإقليمي. هذه البيانات مهمة لدراسة ميكانوسينالينغ من الخلايا البطانية في الموقع. لهذا الغرض، الروتينية الأنسجة المقطعية الأوعية الدموية المقطعية ليست مفيدة. وهكذا، بالنسبة لطب الأوعية الدموية وعلم الأحياء، فمن المهم بشكل خاص للحصول على تقنية لصنع إن وجه استعدادات الأوعية الدموية التي تسمح للمرء أن نلاحظ مساحة واسعة من سطح السفينة وكذلك المناطق تحت السطحية أعمق من السفينة.
كما استعرضها جيليف وسورشيف 1 ، وقد وضعت علماء الأحياء الأوعية الدموية أساليب مختلفة لمراقبة بطانة الأوعية الدموية في وجهه. وقد وضعت بعض الأساليب بارعة في 1940 و 1950. باستخدام هذه الأساليب، كانت قادرة على دراسة التنظيم الأساسي للخلايا البطانية التي خط السطح الداخلي للأوعية الدموية. ومع ذلك، بسبب الطريقة التي تواجهها هذه المستحضرات التحضيرية (ما يسمى طريقة هوتشن 2 ، 3 ، 4 أو تقشير قبالة سطح السفينة 5 ) والطريقة التي تلطخ العينة، لم يكن من الممكن دائما للحصول على المورفولوجية دون انقطاع المعلومات من سطح السفينة إلى المناطق الأعمق من جدار الأوعية الدموية. كله جبل أون وجه إعداد وعاء جنبا إلى جنب مع تلطيخ المناعي سمح لنا ليس فقط دراسة مورفولوجيا الخلايا البطانية والتعبير البروتين وتوطين في هذه الخلايا، ولكن أيضا لتوسيع هذه الدراسات إلى المنطقة تحت البطانية من جدار الوعاء الدموي. الدراسات المبكرة باستخدام الأوعية الدموية أر تواجه الاستعدادات الملون إمونوفلوريسنتلي بدأت تظهر في عام 1980 6 ،f "> 7. مع ظهور المسح بالليزر المجهر متحد البؤر ومؤخرا المجهر مولتيبوتون، يمكن للمرء الآن الحصول على صور واضحة في التركيز من هيكل جدار الأوعية الدموية في عينات من عينات ملون إونوفلورزنتلي في وعاء وكذلك شبكة الأوعية الدموية في الحيوانات الحية 8 ، 9 ، 10 ، 11. هذه تقنيات التصوير القائم على الكمبيوتر تخلق في التركيز الصور المقسمة البصرية، ومن خلال التراص مثل هذه الصور، يمكن للمرء الحصول على صور 3D أعيد بناؤها من جدار الوعاء الدموي وشبكة الأوعية الدموية في الأنسجة، يمكن أن تولد صورا لقسم المحرز على طول المحور Z للصورة أعيد بناؤها 12 ، 13 .
في هذه المقالة، ونحن سوف توضيح طريقة لإعداد إن وجه الاستعدادات من الشريان الأورطي الماوس والشريان السباتي لتلطيخ إمونوفلورسنت. إن وجه الاستعداداتيمكن أن يتم حتى بعد أن تم التلاعب هذه السفن تجريبيا. على سبيل المثال، يمكن أن يكون الشريان السباتي ليغاتد جزئيا ثم إعداد وجه إن بعد هذه الجراحة. لهذا السبب، ونحن سوف تصف أيضا في هذه المقالة كيف نفعل ربط جزئي على الشريان السباتي. وبالمقارنة مع الاستعدادات المماثلة من الحيوانات الكبيرة مثل الفئران والأرانب والبشر، فإن سفن الفأر صغيرة الحجم وأكثر هشاشة، مما يتطلب مزيدا من الرعاية للمناولة أثناء العزلة الجراحية للسفن وإعدادها لتلطيخ الأجسام المضادة والمجهر. لأن النموذج الحيوان الأكثر استخداما لتعديل وراثي هو الماوس، يصبح من الأهمية بمكان للعديد من المحققين للتعامل مع الأوعية الماوس دون الإضرار بها. في هذه المخطوطة، ونحن سوف تصف كيفية التعامل مع الأوعية الدموية الماوس عند صنع الاستعدادات وجهه من الشريان الأورطي الماوس والشريان السباتي. لغرض مظاهرة، سوف نستخدم البرية نوع C57 / B6 الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند التعامل مع الأوعية الدموية الماوس، من المهم أن نتذكر أن البطانة الهشة وأن أي قوة ميكانيكية مفرطة سوف تلحق الضرر الخلايا البطانية. على سبيل المثال، الخلايا البطانية كسر أو فصل من جدار الوعاء الدموي إذا كان بيرفوسد السفينة بشكل قوي جدا، والتي يمكن أن يحدث بسهولة ع?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتدعم الأنشطة البحثية للمؤلفين من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة للدكتور آبي (هل-130193، هل-123346، هل-118462، هل-108551).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag | Fisher Scientific | NC9788429 |
| 12-well plates | Fisher Scientific | 12556005 |
| 6-0 coated vicryl suture | Ethicon | J833G |
| AF488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A11006 |
| AF546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11035 |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 |
| Autoclave Wrap. 24x24in | Cardinal Health | 4024 |
| Blunt retractors, 2.5mm wide | Fine Science Tools | 18200-10 |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 |
| Chlorhexidine Scrub, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC |
| Curity gauze sponges 2×2 | Cardinal Health | KC2146 |
| Electric heating pad, 12X14 | Fisher Scientific | NC0667724 |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Micro cover glass 22x50mm | VWR | 48393059 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-18 |
| normal goat serum | Equitech-Bio | GS05 |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 |
| Petri Dishes 100x15mm | Fisher Scientific | FB0875713 |
| Prolong Gold Antifade mountant with DAPI | Life Technologies | P-36935 |
| Puritan cortton swabs | VWR | 10806-005 |
| Puritan Mini cotton tipped aplicators | VWR | 82004-050 |
| Round handled Needle Holder | Fine Science Tools | 12076-12 |
| Silk Suture 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 |
| Spring scissors | ROBOZ | RS-5601 |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-09 |
| Super Grip Forceps | Fine Science Tools | 00649-11 |
| Transparent Dressing | Cardinal Health | TD-26C |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
References
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -‘thinned-wall’ preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).
- Rogers, K. A., Kalnins, V. I. A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence. J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).
- Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. The regeneration of aortic endothelium. J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).
- Sade, R. M., Folkman, J. En face stripping of vascular endothelium. Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).
- White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ. J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).
- Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress. Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).
- Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy. Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).
- Chèvre, R., et al. High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice. Circ Res. 114, 770-779 (2014).
- Heo, K. -. S., et al. Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function. J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).
- Le, N. -. T., et al. A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ. 127, 486-499 (2013).
- Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ. Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).
- Nigro, P., et al. Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice. J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).
- Jinguji, Y., Fujiwara, K. Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery. Endothelium. 2, 35-47 (1994).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Sci Rep. 6, 34331 (2016).
